3D-Rekonstruktion der Haut und räumliche Kartierung der Immunzelldichte, der Gefäßentfernung und der Auswirkungen von Sonneneinstrahlung und Alterung

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 718 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Kartierung des menschlichen Körpers mit Einzelzellauflösung in drei Dimensionen (3D) ist wichtig für das Verständnis zellulärer Interaktionen im Kontext der Gewebe- und Organorganisation. Die räumliche 2D-Zellanalyse in einem einzelnen Gewebeschnitt kann durch die Zellzahl und die Histologie eingeschränkt sein. Hier zeigen wir einen Arbeitsablauf für die 3D-Rekonstruktion von gemultiplexten sequentiellen Gewebeschnitten: MATRICS-A (Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial - Analysis). Wir demonstrieren MATRICS-A in 26 Serienschnitten fixierter Haut (gefärbt mit 18 Biomarkern) von 12 Spendern im Alter zwischen 32 und 72 Jahren. Beim Vergleich der 3D-rekonstruierten Zelldaten mit den 2D-Daten zeigen wir deutlich kürzere Abstände zwischen Immunzellen und vaskulären Endothelzellen (56 µm in 3D vs. 108 µm in 2D). Wir zeigen auch 10–70 % mehr T-Zellen (insgesamt) innerhalb von 30 µm von einer benachbarten T-Helferzelle in 3D vs. 2D. Die Abstände der p53-, DDB2- und Ki67-positiven Zellen zur Hautoberfläche waren über alle Altersgruppen/Sonnenexposition hinweg gleich und größtenteils auf die untere Stratum-Basale-Schicht der Epidermis beschränkt. MATRICS-A bietet einen Rahmen für die Analyse räumlicher 3D-Zellbeziehungen in gesunden und alternden Organen und könnte weiter auf erkrankte Organe ausgeweitet werden.

Das Human Biomolecular Atlas Program (HuBMAP) der National Institutes of Health (NIH) zielt darauf ab, einen umfassenden hochauflösenden Atlas aller Zellen im gesunden menschlichen Körper zu erstellen und dabei Daten aus mehreren Labors in den USA und Europa zu nutzen1. Eine große Herausforderung besteht darin, die aus diesen Proben gewonnenen Daten zu integrieren, zu harmonisieren und sie in einem gemeinsamen dreidimensionalen (3D) Raum abzubilden. HuBMAP erstellt in enger Zusammenarbeit mit 17 anderen internationalen Konsortien und Projekten systematisch einen Human Reference Atlas (HRA)2. Das Herzstück dieses Atlas ist ein gemeinsames Koordinatensystem (CCF), das die räumlich und semantisch explizite Registrierung und Erforschung menschlicher Gewebe unterstützt. Der fertige Atlas wird den Entwurf eines „digitalen Zwillings“ für gesunde Männer und Frauen unterstützen, der zur Unterstützung präziser Gesundheit und Medizin parametrisiert werden kann. Das CCF besteht aus zwei Schlüsselkomponenten: (1) Anatomische Strukturen, Zelltypen und Biomarker-Tabellen (ASCT + B) für jedes Organ, die vorhandene Ontologien nutzen (z. B. Uberon Multi-Spezies-Anatomie-Ontologie, Foundational Model of Anatomy Ontology [FMA]) , Cell Ontology [CL] oder HUGO Gene Nomenclature [HGNC]) und (2) eine 3D-Referenzobjektbibliothek, die anatomische Strukturen und Zelltypen für jedes Organ räumlich definiert und ihre räumlichen 3D-Beziehungen innerhalb des menschlichen Körpers charakterisiert. Mithilfe des Atlas können Gewebedaten räumlich und semantisch registriert werden (unter Verwendung standardisierter und einheitlicher Namen für Anatomie, Zelltypen und Biomarker). Dieser Artikel konzentriert sich auf die Generierung von 3D-Hautdaten und die automatisierte Berechnung von 3D-Raumkarten. Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass die Dichte von Immunzellclustern in 3D, Abstandsverteilungen für Immunzellen zur nächstgelegenen Endothelzelle in 3D und der Abstand beschädigter oder proliferierender Zellen zur Hautoberfläche dargestellt wurden.

Die Haut ist das größte menschliche Organ. Es besteht aus mindestens 36 verschiedenen Zelltypen (dokumentiert in Version 1.2 von ASCT + B3) und einer riesigen Mikroumgebung von über 16 anatomischen Strukturen, darunter Drüsenstrukturen, Haarfollikel, Gefäße und Komponenten des Immunsystems. Mindestens 70 Proteinbiomarker werden üblicherweise zur Charakterisierung wichtiger Hautzelltypen und anatomischer Strukturen verwendet3. Während in den letzten Jahren mehrere Einzelzellatlasstudien der menschlichen Haut durchgeführt wurden4,5, konzentrierten sich diese auf die RNAseq-Analyse einzelner Zellen (sc) und nicht auf die 2D-in-situ- oder 3D-räumliche Analyse von Zelltypen und Proteinen. Eine eingehende proteomische Analyse gesunder Haut identifizierte 10.701 Proteine ​​und nutzte fortschrittliche Dissektion und Durchflusszytometrie, um sie der Position innerhalb der Hautschichten und dem zellulären Ursprung zuzuordnen6. Während viel Arbeit in die Charakterisierung präkanzeröser und krebsartiger Haut investiert wurde, gibt es weniger Erkenntnisse über zelluläre Veränderungen bei ansonsten gesunden Personen im gesamten Lebenszyklus, einschließlich der Auswirkungen von UV7,8. Eine kürzlich durchgeführte multimodale Analyse (Kombination von scRNAseq, räumlicher Transkriptomik und Multiplex-Ionenstrahl-Bildgebung)9 von kutanem Plattenepithelkarzinom (cSCC) und entsprechender normaler Haut zeigte weitgehend überlappende Keratinozytenpopulationen mit nur einer einzigen tumorspezifischen Keratinozyten-Subpopulation im sSCC. Dies unterstreicht den Wert der Entwicklung normaler/gesunder Referenzorgandatensätze, um den zellulären Übergang zur Krankheit zu verstehen.

In den letzten Jahren gab es eine wachsende Zahl von Untersuchungen zur Zellbiologie gesunder und kranker Organe in 3D10,11,12,13,14,15,16,17. Speziell in Bezug auf die Haut verwendeten Wang et al.18 konfokale Mikroskopie, um Blutgefäße und Lymphnetzwerke in der menschlichen Dermis mittels Immunfärbung für CD31 (Endothelzellen), Podoplanin und LYVE1 (Lymphzellen) darzustellen. Lichtblattmikroskopie wurde verwendet, um die Hautstruktur in 3D10 abzubilden. Allerdings führt die Verwendung von Objektiven mit niedriger numerischer Apertur und geringer Vergrößerung, die zur Erzielung eines weiten Sichtfelds erforderlich sind, zu einer geringen räumlichen Auflösung auf zellulärer Ebene. Die 3D-Rekonstruktion seriell geschnittener H&E-gefärbter Haut-/Kopfhautproben mit der CODA-Methode hat Variationen in der Dermisstruktur und anderen anatomischen Merkmalen, einschließlich Haarfollikeln und Gefäßen, gezeigt19. In onkologischen Anwendungen kombinierte die 3D-Rekonstruktion von Dickdarmkrebs12 serielle H&E-Schnitte (n = 22) und serielle Multiplexbilder (n = 25) und zeigte Merkmale in 3D, die in 2D nicht erkennbar waren, einschließlich der Interkonnektivität histologischer Strukturen in der Tumormikroumgebung. wie Tumorknospen sowie zelluläre und morphologische Übergänge und Gradienten. Bildgebende Massenzytometrie von seriell geschnittenen Gewebeschnitten (n = 152) von Brustkrebs, die in 3D13 rekonstruiert wurden, zeigte eine Heterogenität der Zellen und der Mikroumgebung, die in 2D nicht messbar war, einschließlich mehr Zell-Zell-Wechselwirkungen und Kolokalisierung (z. B. pS6+-Zellen und SMA+-Zellen) und Cluster von invasive Zellen.

Im Allgemeinen ist die Rekonstruktion von 3D-Volumina aus 2D-Serienschnitten ein komplexer Vorgang und kann beim Fehlen externer Referenzstrukturen unter dem „Bananeneffekt“ leiden (bei dem gekrümmte Strukturen während der Bildregistrierung falsch gerade ausgerichtet werden)20,21. Darüber hinaus ist der 3D-Rekonstruktionsprozess tendenziell rechenlang langsam. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir einen automatisierten, reproduzierbaren Arbeitsablauf (Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial – Analysis – MATRICS-A) für die 3D-Rekonstruktion von stark multiplexierten Gewebeschnitten entwickelt. Im Vergleich zu früheren 3D-Rekonstruktionsmethoden14,15,16,17 wird unser Ansatz mithilfe von Mikro-CT-Bildern des formalinfixierten Blocks kalibriert, wodurch die Genauigkeit der 3D-Rekonstruktion verbessert (und der „Bananeneffekt“ verringert wird). Wir demonstrieren den Nutzen von MATRICS-A in multiplexierten seriellen Hautschnitten, die von jüngeren und älteren Spendern und verschiedenen anatomischen Regionen entnommen wurden. Wir bieten interaktive Visualisierungstools für 3D-Zelldaten in der Epidermis und Dermis der Haut, einschließlich der Dichte von Immunzellclustern, räumlichen Abständen zwischen Immunzellen und nächstgelegenen Endothelzellen sowie der Lokalisierung von durch ultraviolette (UV) Strahlung geschädigten Zellen (z. B. p53-Mutationen). Marker für DNA-Reparatur (DDB2), Proliferation (Ki67) und ihre Entfernung zur Hautoberfläche. Beim Vergleich der 3D-rekonstruierten Daten mit den 2D-Daten aus jedem Abschnitt zeigen wir deutlich kürzere Abstände zwischen Immunzellen und vaskulären Endothelzellen (56 µm in 3D vs. 108 µm in 2D). Die meisten T-Helferzellen wurden innerhalb von 25 µm von der nächstgelegenen Endothelzelle gefunden, daher ist es möglich, dass räumliche Beziehungen zum Gefäßsystem in 2D nicht vollständig berücksichtigt werden. Wir zeigen auch 10–70 % mehr T-Zellen (insgesamt) innerhalb von 30 µm von einer benachbarten T-Helferzelle in 3D vs. 2D. Dies ist ein wichtiger Gesichtspunkt bei Proben mit geringer Immunzelldichte, bei denen es schwierig sein kann, räumliche Beziehungen und Zell-Zell-Interaktionsanalysen in 2D genau zu quantifizieren. Die Abstände der p53-, DDB2- und Ki67-positiven Zellen zur Hautoberfläche waren über alle Altersgruppen/Sonnenexposition hinweg gleich und größtenteils auf die untere Stratum-Basale-Schicht der Epidermis beschränkt. Dies stimmt mit früheren Studien überein, die zeigen, dass Ki67- und/oder p53-positive Zellen erst dann zunehmen, wenn eine aktinische Keratose (Schädigung der Keratinozyten im unteren Drittel der Epidermisschicht) oder ein präkanzeröser/kanzeröser (volle Epidermisdicke) Plattenepithelkarzinom in situ vorliegt erreicht ist22. Die MATRICS-A-Software bietet ein Open-Access-Framework für die 3D-Rekonstruktion von multiplexiertem Gewebe und trägt dazu bei, das Verständnis von Zell-Zell-Beziehungen, einschließlich Immunzellinteraktionen und Gefäßabständen in der Haut, zu verbessern, was auf andere Organe und Krankheitszustände ausgeweitet werden kann.

Der End-to-End-Arbeitsablauf für diese Studie ist in Abb. 1 dargestellt. Um die für die Rekonstruktion benötigten Proben zu generieren, nutzten wir archivierte formalinfixierte, gesunde Hautbiopsien von 12 Spendern (Altersbereich 32–72 Jahre) (Ergänzungstabelle 1). . Die Proben wurden zugeschnitten (Größenbereich ~ 2 bis 7 mm), wobei die Epidermis- und Dermisstruktur erhalten blieb, und in einen einzelnen Paraffinblock eingebettet (Layout in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt). Wir verwendeten ein 3D-Referenzorgan der menschlichen männlichen und weiblichen Haut, um die Biopsien über die HuBMAP Registration User Interface (RUI) räumlich zu registrieren und semantisch zu kommentieren (ergänzende Abbildung 2)23. Diese Referenzorgane wurden aus den Daten des Visible Human-Projekts24 der National Library of Medicine (NLM) abgeleitet und dem HuBMAP RUI hinzugefügt, wodurch es möglich wurde, alle Gewebeproben offiziell im sich entwickelnden Human Reference Atlas zu registrieren. Die resultierenden Metadaten für jeden Gewebeblock dokumentieren die Größe, räumliche Lage und Rotation in 3D. Alle in dieser Studie verwendeten registrierten Gewebeblöcke können im CCF Exploration User Interface (CCF-EUI)25 des HuBMAP-Portals interaktiv erkundet werden.

(1) Gesunde Hautbiopsien wurden in einen einzelnen formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeblock eingebettet. Das 3D-Referenzorgan der menschlichen männlichen und weiblichen Haut wurde verwendet, um die Biopsien über die HuBMAP-Registrierungsbenutzeroberfläche räumlich zu registrieren und semantisch zu kommentieren. (2) Hautbiomarker wurden mithilfe der Haut-ASCT + B-Tabellen identifiziert und entsprechende Antikörper validiert; (3) Der Gewebeblock wurde einer Mikro-CT-Bildgebung unterzogen und dann für eine hochmultiplexierte Immunfluoreszenzbildgebung unter Verwendung von 18 Protein- und Zelltypmarkern in 26 Serienschnitte unterteilt; (4) Die Zellklassifizierung wurde für jeden Abschnitt mithilfe eines hybriden überwachten (auf Deep Learning basierenden) und unüberwachten (wahrscheinlichkeitsbasierten) GMM-Workflows durchgeführt. Anschließend wurden 2D-Serienschnitte und segmentierte Zellen einer 3D-Rekonstruktion unterzogen. Die räumliche 3D-Position der Zellen wurde verwendet, um die Clusterdichte von Immunzellen, die Verteilung von Immunzellen aus Endothelzellen sowie die Verteilung und Abstände von p53-, DDB2- und Ki67-positiven Zellen von der Hautoberfläche zu berechnen. Erstellt mit BioRender.com.

Im Einklang mit der HuBMAP-Mission, alle Zelltypen in den untersuchten Organen zu dokumentieren, wurde eine Tabelle mit anatomischer Struktur, Zelltyp und Biomarkern (ASCT + B) für die Haut erstellt. Die Tabelle wurde in Absprache mit Organexperten erstellt und bietet einen Referenzrahmen für alle wichtigen Zelltypen, ihre anatomische Lage und die Proteinbiomarker, die zur Charakterisierung dieser Zelltypen verwendet werden. Die Haut-ASCT + B-Mastertabelle3 der Version 1.2 erfasst drei kritische Elemente: (1) die Teilbeziehungen zwischen 15 anatomischen Strukturen, die mit ihren jeweiligen Uberon-IDs verknüpft sind; (2) die 36 Hautzelltypen (im Zusammenhang mit der CL-Ontologie), die sich in einer oder mehreren dieser anatomischen Strukturen befinden; und (3) 70 Proteinbiomarker (verknüpft mit der HGNC-Ontologie), die üblicherweise zur Charakterisierung der 36 Zelltypen verwendet werden. Eine Teilmenge des Haut-ASCT + B-Berichts ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Die vollständige Tabelle mit allen 36 Zelltypen und 70 Biomarkern ist auch auf unserer Companion-Website26 zugänglich und kann interaktiv über das HuBMAP ASCT + B Reporter-Tool27 erkundet werden. Hier konzentrieren wir uns auf eine Teilmenge der Haut-ASCT + B-Tabelle, die 14 Zelltypen und/oder anatomische Strukturen umfasst, die sich über die Epidermis (Stratum granulosum, Stratum spinosum und Stratum basale), Keratinozyten und Dermis (Drüsenstrukturen, Fibroblasten, Makrophagen, T-Helferzellen) erstrecken , T-Killerzellen, T-Regs, Nervenfasern und Endothelzellen) sowie Marker für DNA-Schäden (p53), DNA-Reparatur (DDB2) und Zellproliferation (Ki67) (zusammengefasst in der Ergänzungstabelle 2). Der Grund für die Auswahl dieser Biomarker bestand darin, (1) die Immunzelldichte in 3D vs. 2D zu quantifizieren; (2) räumliche 3D-Beziehungen zwischen Immunzellen und nächstgelegenen Endothelzellen demonstrieren; (3) Messen Sie die räumlichen zellulären Auswirkungen von Alterung und Sonneneinstrahlung auf Epidermiszellen. Informationen zu den Antikörpern für jedes Zielprotein finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Im Handel erhältliche Antikörper wurden mithilfe eines standardisierten Protokolls validiert und konjugiert28 (siehe Methoden) und ein Organ-Mapping-Antikörper-Panel (OMAP) wurde entwickelt und als Teil der 4. HRA-Veröffentlichung29 veröffentlicht. Wir verwendeten zwei Zytokeratin-Cocktails CK26 (KRT1, KRT5, KRT6 und KRT8) und AE1 (KRT10, KRT14, KRT15, ​​KRT16 und KRT19), die eine breite Keratinozytenabdeckung aufwiesen. Beispielsweise färbte PCK26 die gesamte Epidermis und AE1 war eher in der unteren Hälfte der Epidermis lokalisiert, wodurch das Stratum basale hervorgehoben wurde. Beide Zytokeratin-Cocktails färbten auch Adnexdrüsen- und Haarfollikeleinheiten in der Dermis. Allerdings wäre eine zusätzliche Färbung mit spezifischen Keratinen erforderlich, um jeden der spezifischen Zelltypen aufzulösen (z. B. KRT10 für granuläre Keratinozyten30). In zukünftigen Studien können zusätzliche Marker einbezogen werden, um eine höhere Zellspezifität zu erreichen (z. B. Haarfollikel-Stammzellen) und mit räumlichen transkriptomischen Methoden kombiniert werden, um eine noch höhere Auflösung zu erreichen.

Der Gewebeblock mit den 12 Hautproben wurde zunächst einer Mikro-CT-Bildgebung unterzogen (siehe Methoden und ergänzende Abbildung 4), gefolgt von einer Aufteilung in 100 × 5 µm große Abschnitte. 26 der Serienschnitte mit der besten Qualität wurden für die Analyse heruntergewählt (um den Abstand zu minimieren, wurden nicht mehr als zwei aufeinanderfolgende Abschnitte zwischen jedem beibehaltenen Abschnitt ausgeschlossen). Jeder Abschnitt wurde einer Multiplex-Immunfluoreszenzbildgebung mit 18 Hautbiomarkern plus Kernmarker DAPI unterzogen (siehe Methoden). Unsere Methode bietet einen integrierten Arbeitsablauf für die 2D-Segmentierung und Klassifizierung von Zelltypen aus den Multiplex-Bildern, gefolgt von einer automatisierten 3D-Rekonstruktion (siehe Methoden und ergänzende Abbildungen 5a, b). Die Zelltypklassifizierung ist in der Regel nicht in Segmentierungsabläufe integriert, und es wird häufig eine manuelle Schwellenwertermittlung/Gating des Biomarkersignals oder eine Clusterung segmentierter Zellen verwendet, was manuell und fehleranfällig ist. Wir haben ein hybrides überwachtes und unüberwachtes Segmentierungs-/Klassifizierungsmodell entwickelt, bei dem zunächst ein überwachtes Deep-Learning-Modell (DL) für die 2D-DAPI-/Kernsegmentierung verwendet wurde, gefolgt von unüberwachten Gaußschen Mischungsmodellen (GMM)31 für die probabilistische Segmentierung/Klassifizierung einzelner Zelltypen (d. h. epithelial und immun) und DNA-Schadens-/Reparatur- und Proliferationsmarker (d. h. p53, DDB2 und Ki67). GMM ist ein hervorragendes Werkzeug zur gleichzeitigen Bildnormalisierung und Erkennung relativer Änderungen der Biomarkerintensität und ermöglicht eine robuste Klassifizierung in jedem Abschnitt. Die Kombination von DL und GMM bietet eine verallgemeinerbare Lösung für die Zellsegmentierung und -klassifizierung, die für große Datensätze ganzer Objektträgerbilder funktioniert. Zwar stehen für die Zellsegmentierung mehrere Open-Source-Optionen zur Verfügung (z. B. CellSeg32, Cell Profiler33 oder StarDist3D34), doch angesichts der großen Datenmenge, die für 26 serielle Abschnitte (ca. 15 GB und mehr) generiert wird, wäre die Implementierung hier relativ zeitaufwändig gewesen ~40 zusammengefügtes FOV pro Probe (0,832 mm × 0,702 mm/FOV). Typischerweise sind Tausende manuell annotierter Zellen erforderlich, um ein DL-basiertes Segmentierungsmodell zu entwickeln, und manuelle Annotationen führen zu Variabilität zwischen und innerhalb der Bewerter. Zum Beispiel die Für die Entwicklung des CellSeg-Modells waren mehr als 29.000 manuell segmentierte Kerne erforderlich, um ein DAPI-basiertes Kernsegmentierungsmodell zu erstellen32. Unser Hybridansatz ist schneller und allgemeiner anwendbar für die Verarbeitung größerer Gewebebilder und beruht nicht auf der manuellen Abstimmung der Bildschwellenwerte, Bild Normalisierung und morphologische Operationen (Medianfilterung, Differenz von Gauß) und Parameter des Wassereinzugsgebietsalgorithmus (wie Gradientenschwellenwerte und Diffusionswerte). Für den Zweck dieser Studie ist sie derzeit auf Kernsegmentierung und Kern-/perinukleäre Marker beschränkt, aber Der Arbeitsablauf ist anpassbar und kann durch Dilatation oder Einbeziehung von Membranmarkern wie Pan-Cadherin oder Na+K+ATPase35 auf ganze Zellen ausgeweitet werden. Wir fanden für alle Marker eine ausgezeichnete Sensitivität (93–100 %), Spezifität (85–100 %) und eine Genauigkeit von über 90 % (Abb. 2a–e) im Vergleich zu manuellen Anmerkungen (siehe Methoden). Wir haben die Anzahl der Immunzellen weiter mit früherer Literatur in gesunder Haut verglichen und vergleichbare Ergebnisse gefunden. Nachdem wir jede Probe auf 1 cm × 5 μm skaliert hatten, schätzten wir eine mittlere Anzahl von 712 T-Zellen (SD = 329, n = 10), was mit dem zuvor gemeldeten mittleren Wert von 590 T-Zellen (SD = 105) in 1 cm vergleichbar ist × 5 μm Hautschnitte36. Mehr als 95 % der T-Zellen in normaler Haut wurden als T-Gedächtnis- oder Helferzellen identifiziert37, wobei T-Reg-Zellen schätzungsweise 10 % der gesamten T-Zellpopulation ausmachen38. Wir fanden auch eine ähnliche Verteilung der T-Helfer (89 ± 5 %); T-Killer (2 ± 5 %) und T-Regs (9 ± 5 %).

eine Beispielregion von Interesse innerhalb eines Multiplexbildes von Spender 9 (Region 3); GMM wurde verwendet, um verschiedene Zelltypen automatisch zu segmentieren/klassifizieren. Unterregionen von Interesse werden in b–d-Panels mit Wahrscheinlichkeitskarten für jeden Zelltyp angezeigt; b Zytokeratin-CK26-Epidermisfärbung und angrenzende Wahrscheinlichkeitskarte von Epidermiszellen, überlagert mit dem virtuellen H&E; c Endothelzellen von Blutgefäßen (CD31) und angrenzende Wahrscheinlichkeitskarte von Endothelzellen; d p53-Färbung in der Epidermis und angrenzende Wahrscheinlichkeitskarte von p53-positiven Zellen; e Die Sensitivitäts-, Spezifitäts- und Genauigkeitsmetriken für den Zellklassifizierungs-Workflow für neun Biomarker unter Verwendung manueller Anmerkungen.

For 3D reconstruction of the serial sections, we first manually select one reference 2D AF image from the stack of 26 serial images (Fig. 3a, b and Methods). All AF images used for reconstruction are unstained (i.e., the image is taken prior to any marker staining), hence AF-based registration is independent of biomarker signal or signal variations associated with staining. Compared to other registration approaches that have been used for 3D reconstruction14, we automatically segment AF in each serial image using Otsu thresholding, morphological closing, and retaining the largest component39 (Fig. 3c) to generate a 2D AF mask. The 2D AF mask focuses registration on a region of interest (ROI) and filters out background noise or artefacts that may interfere with the registration process. Post serial image registration, 3D volumes of AF and cells are created, and 3D connectivity of all cells is used to fuse overlapping cells in adjacent serial sections to prevent overcounting (Fig. 3d, e). We use ITK’s 3D connected component image filter to merge overlapping cells and classify cells in 3DClass Template Reference. https://itk.org/Doxygen/html/classitk_1_1ConnectedComponentImageFilter.html (2023)." href="/articles/s42003-023-04991-z#ref-CR40" id="ref-link-section-d87231388e979"> 40,41. Der Bildfilter für verbundene Komponenten wurde in der Vergangenheit zum Zusammenführen von Segmentierungen in 3D42,43,44 und zur Verfeinerung der Zellsegmentierung in 2D45 verwendet. Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass eine 3D-verbundene Komponente verwendet wurde, um überlappende Zellen in seriellen histologischen Schnitten in 3D zu verschmelzen. Der mittlere Würfelähnlichkeitskoeffizient (DSC)46 wurde verwendet, um die Genauigkeit der Bildregistrierung zu beurteilen, und wir fanden eine Überlappungsgenauigkeit von 0,95 ± 0,04 für 24 serielle Abschnitte in den zehn rekonstruierten Hautvolumina (die letzten beiden Abschnitte wurden für Deep-Learning-Training verwendet und ausgeschlossen). . Ein Überlappungs-DSC von 0,90 wird in der 3D-Registrierungs- oder Rekonstruktionsgemeinschaft als hochwertig eingestuft14. Die normalisierte Kreuzkorrelation zwischen den AF-Serienschnitten (ein Maß für die Registrierungsqualität) betrug für alle AF-Serienschnitte 0,6 ± 0,07. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit etablierten 3D-Rekonstruktionsmethoden13 und ist angesichts der Verformung/Beschädigung, die während des zyklischen Multiplexens auftreten kann und sich negativ auf die genaue Registrierung auswirken könnte, gut. Außerdem wurden aus jedem der rekonstruierten Hautvolumina zufällig Objektträger ausgewählt und zur visuellen Validierung segmentierte Zellen und Biomarker über die Bilder gelegt. Um potenzielle Probleme im Zusammenhang mit einer höheren oder niedrigeren Signalintensität für einen Objektträger abzumildern, wurden etwaige Abweichungen in der Zelldichte eines Biomarkers identifiziert und ein höherer oder niedrigerer Wahrscheinlichkeitsschwellenwert für die probabilistische Segmentierung verwendet, um die Segmentierung zu verbessern. Solche manuellen Anpassungen der Biomarker-Wahrscheinlichkeit waren in weniger als 2 % des gesamten Datensatzes der Objektträgerbilder erforderlich.

a, b Ein Referenz-Autofluoreszenzbild aus den nacheinander abgebildeten Abschnitten wird verwendet, um die Registrierung zu initiieren; c Eine fleckenbasierte lokale Korrespondenz in 2D-Serienschnitten wird für die affine Registrierung verwendet, gefolgt von einer deformierbaren Registrierung, um Gewebeverformungen zu berücksichtigen; d Die 3D-Rekonstruktion der segmentierten Zellen wird durch die Kartierung der Zellen in 3D mithilfe der affinen und verformbaren Transformationskarte erreicht und die Verfeinerung wird durch die Registrierung im Mikro-CT-Bild erreicht. e 3D-Volumina klassifizierter Zellen, überlagert mit dem AF-Volumen und dem 3D-Netz.

Das Verstehen und Kommunizieren der räumlichen 3D-Positions- und Abstandsbeziehungen mehrerer Zelltypen sowie die Unterstützung des Vergleichs der Zelltyp-Abstandsverteilungen zwischen Spendern und Bedingungen ist nicht trivial. Für diese Studie wurden drei interaktive Visualisierungen entwickelt, um diesem Bedarf gerecht zu werden: (1) Clusterdichtediagramme, die die Anzahl der Zellen innerhalb eines bestimmten Abstands veranschaulichen und quantifizieren (wir haben sowohl 15 als auch 30 µm ausgewertet, wobei letzteres biologisch aussagekräftigere Ergebnisse liefert). ; (2) eine 3D-Gefäß-CCF-Visualisierung (VCCF) zur Veranschaulichung der räumlichen Beziehungen und Abstände zwischen Immunzellen und nächstgelegenen Endothelzellen in 2D und 3D; und (3) räumliche Darstellungen, die die Abstände zwischen UV-geschädigten und proliferierenden Keratinozyten und der Hautoberfläche quantifizieren. Die interaktiven 3D-Visualisierungen sind über die Begleitwebsite zugänglich: Begleitwebsite für „Human Digital Twin: 3D Atlas Reconstruction of Skin and Spatial Mapping of Immune Cell Density, Vascular Distance and Effects of Sun Exposure and Aging“ | (hubmapconsortium.github.io)) und ermöglichen die Untersuchung jeweils einer 3D-rekonstruierten Region. Benutzer können einen oder mehrere Serienabschnitte anzeigen; In diesen Abschnitten können sie einen oder mehrere Zelltypen/Marker anzeigen. Sie können die automatisch aktualisierten Distanzverteilungsdiagramme unterhalb der 3D-Hautvisualisierung überprüfen. Darüber hinaus können sie für den histologischen Kontext auf das virtuelle H&E-Bild zugreifen (als repräsentatives Bild wurde ein mittleres Bild im Stapel mit 26 Bildern ausgewählt). Wie weiter unten ausführlicher beschrieben, sind statische Beispiele in Abb. 4c – e (Immunclusterdichte), Abb. 5c (Abstand zwischen Immunzellen und Endothelzellen); und Abb. 6b, c (Abstand der für p53 (DNA-Schädigung), DDB2 (DNA-Reparatur) und Ki67 (Proliferation) positiven Keratinozyten zur Hautoberfläche).

Für jede Spenderprobe wird die durchschnittliche Anzahl aller Immunzellen innerhalb von 30 µm um eine T-Helferzelle in 2D (rot) und 3D (blau) angezeigt. Insgesamt war die Anzahl der Immunzellen innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle in 3D höher als in 2D, wobei in 3D 10–70 % mehr Zellen gefunden wurden. Fehlerbalken stellen das 95 %-Konfidenzintervall dar. Jeder Fehlerbalken wurde aus unabhängigen T-Helferzellen abgeleitet, die in jeder Region nachgewiesen wurden (n = 10 biologisch unabhängige Proben). Die Anzahl der T-Helferzellen für jede Region wird ebenfalls angezeigt; b Maximale Anzahl von Immunzellen innerhalb von 30 µm um eine T-Helferzelle. Es gab Unterschiede in allen Regionen, zum Beispiel wurde in Region 7 in 3D eine Ansammlung von 11 Immunzellen innerhalb von 30 µm gefunden, während in 2D drei Zellen quantifiziert wurden. c Visualisierung einer geringen Dichte von Immunzellclustern in 3D. Das Diagramm der Immunzellclusterdichte wird aus Region 1 (Kopfhautregion, ausgeprägte Sonneneinstrahlung, männlich, 72 Jahre alt) erstellt. Die Größe und Farbe der violetten Blasen zeigen, dass diese Probe in 3D eine relativ geringe Anzahl benachbarter Immunzellen aufweist. Zur interaktiven Visualisierung von 3D- und 2D-Schnitten gehen Sie zu: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/immune_cluster/immune_cluster_region_1_30.htmld Visualisierung der mittleren bis hohen Dichte von Immunzellclustern in 3D. Diagramm mit mittlerer bis hoher Immunclusterdichte aus Region 9 (untere distale Armregion, deutliche Sonneneinstrahlung, männlich, 60 Jahre alt). Die erhöhte Anzahl, Größe und Farben (von Rosa zu Gelb) der Blasenprobe zeigen die höhere Anzahl benachbarter Immunzellen in 3D. Zur interaktiven Visualisierung des 3D- und 2D-Abschnitts: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/immune_cluster/immune_cluster_region_9_30.htmle Visualisierung einer hohen Dichte von Immunzellclustern in 3D. Diagramm mit hoher Immunclusterdichte aus Region 12 (Biopsie wurde von der rechten Flanke entnommen, aber aufgrund von Narbenbildung von der weiteren Analyse ausgeschlossen; der Spender hatte auch systemischen Lupus erythematodes). Die hohe Anzahl orangefarbener und gelber Blasen zeigt eine große Anzahl benachbarter Immunzellen in 3D (4–6+ Zellen mit Clustern mit der höchsten Dichte, gemäß der farbcodierten Legende) und zeigt eine hohe Immunclusterdichte. Zur interaktiven Visualisierung gehen Sie zu: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/immune_cluster/immune_cluster_region_12_30.html. Auf alle Regionen kann zugegriffen werden unter: Begleitwebsite für „Human Digital Twin: 3D Atlas Reconstruction of Skin and Spatial Mapping of Immune Cell Density, Vascular Distance and Effects of Sun Exposure and Aging“ | ㅤ (hubmapconsortium.github.io).

a Histogramme der Entfernung zu den nächstgelegenen Endothelzellen jedes Immunzelltyps (CD68, T-Helfer, T-Killer und T-Reg). Der 3D-Abstand zu Immunzellen ist typischerweise viel kürzer (im Durchschnitt ~56 µm in 3D gegenüber 108 µm in 2D); b Der Kolmogorov-Smirnov-Test mit zwei Stichproben (zweiseitig) wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der 2D- und 3D-Verteilung für alle Immunzelltypen gibt (D = 0,43, p-Wert <2,2e-16; n = 13.481 ( (in 2D) und n = 13.489 (in 3D) waren in jeder Verteilung unabhängige Immunzellen enthalten. c Der Abstand zwischen Immunzellen und nächstgelegenen Endothelzellen steht im Einklang mit Alterung und Sonneneinstrahlung. Geigendiagramme werden für jeden Spender angezeigt und nach Alter sortiert. Es gab einen Trend zu einer höheren Anzahl von T-Killerzellen näher an Endothelzellen bei jüngeren gegenüber älteren Patienten (Spearman-Korrelation = –0,73 (p = 0,02, angepasster p-Wert = 0,08, ergänzende Abbildung 7c (n = 9 unabhängige Proben) wurden verwendet ). Die interaktive Version dieses Diagramms finden Sie unter: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/violin_cell.htmld Beispiel einer Hautregion mit einer höheren Anzahl an Immunzellen innerhalb von 100 µm von Endothelzellen . Rekonstruierte 3D-Distanzkarte für Immunzellen und nächstgelegene Endothelzellen. Das gezeigte Beispiel gilt für Region 4 (oberer Bauch, leichte Sonneneinstrahlung, männlich, 48 Jahre alt); Histogrammdiagramm, das die Verteilung der Immunzellen innerhalb von 50–200 µm zeigt, mit die höchste T-Killerzellzahl innerhalb von 25–50 µm. Für interaktive Visualisierung in 3D und 2D gehen Sie zu: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/region_4.html).

a Violindiagramme für Abstände zwischen DDB2-, p53-, Ki67-positiven Zellen und der Hautoberfläche werden für jeden Spender angezeigt und nach Alter sortiert. Die meisten positiven Zellen befanden sich in einem Abstand von 100–200 µm von der Hautoberfläche. Allerdings wiesen die Regionen 1, 9 und 2 positive Zellen bis zu 1600 µm auf, die in Haarfollikeln lokalisiert waren. Die interaktive Version dieser Darstellung finden Sie unter: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis_entire/violin_damage_epidermis.htmlb Beispiel einer höheren Verteilung von DDB2-positiven Zellen innerhalb von 200 µm Abstand von der Hautoberfläche in ein jüngerer Spender. Während wir in Bezug auf Alterung oder Sonneneinstrahlung keine Unterschiede in den Abständen zur Hautoberfläche fanden, gab es eine signifikante umgekehrte Korrelation zwischen DDB2-positiven Zellen und Alter (korr. = –0,78, adj. p = 0,05, ergänzende Abbildung 9a). Dies deutet auf eine höhere Fähigkeit zur DNA-Reparatur bei jüngeren Spendern hin. Das Beispiel stammt aus Region 11 (vom Oberarm, leichte Sonneneinstrahlung, weiblich, 41 Jahre alt) und zeigt eine höhere Verteilung von DDB2-positiven Zellen innerhalb von 200 µm Abstand von der Hautoberfläche und eine geringere Verteilung von Zellen, die für p53 und Ki67 positiv sind . Zur interaktiven Visualisierung gehen Sie zu: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis/epidermis_region_11.htmlc Beispiel einer geringeren Verteilung von DDB2-positiven Zellen innerhalb von 200 µm Abstand von der Hautoberfläche bei einem älteren Spender. Das gezeigte Beispiel ist Region 7 (vom unteren Unterarm, starke Sonneneinstrahlung, männlich, 69 Jahre alt) und zeigt die höchste Verteilung von Ki67-positiven Zellen innerhalb von 200 µm Abstand von der Hautoberfläche, mit niedrigeren p53- und niedrigsten DDB2-positiven Zellen. Zur interaktiven Visualisierung gehen Sie zu: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis/epidermis_region_7.html. Alle Regionen finden Sie unter: Begleitwebsite für „Human Digital Twin: 3D-Atlas-Rekonstruktion der Haut und räumliche Kartierung der Immunzelldichte, der Gefäßentfernung und der Auswirkungen von Sonneneinstrahlung und Alterung“ | ㅤ (hubmapconsortium.github.io).

Frühere Messungen der gesamten T-Zellzahl in der Haut basierten auf 2D-Gewebeschnitten36. Unter Verwendung der 3D-rekonstruierten Volumina und nach Korrektur überlappender Zellen schätzten wir die mittlere Anzahl von T-Zellen/cm3 Haut auf 33,5 × 106 (SD 15,6 × 106) (Ergänzungstabelle 4). Dieses Ergebnis liefert einen weiteren Beweis dafür, dass die Haut eine große Reserve an T-Zellen ist, und die große Variation wird auf anatomische Unterschiede in der Hautdicke, Alterung, Sonneneinstrahlung, Gesundheitszustand usw. zurückgeführt. Da die Hautdicke nicht einheitlich ist, würde ein ideales Studiendesign dies tun Sammeln und analysieren Sie Proben von verschiedenen anatomischen Stellen desselben Patienten, was hier nicht möglich war. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der normalisierten Anzahl (angepasst an das 3D-Gewebevolumen) von Makrophagen, T-Killerzellen, T-Helferzellen oder T-Reg-Zellen nach Alter oder in der Haut von Spendern mit leichten bis ausgeprägten chronischen sonnenexpositionsbedingten Veränderungen (Ergänzung). Abb. 6a–g). Es gab einen Trend für eine positive Beziehung zwischen dem T-Helfer/T-Killer-Verhältnis und dem Alter (korr. = 0,82, adj. p = 0,07) (ergänzende Abbildung S6h).

Anschließend verglichen wir die Immunzelldichte in 2D mit 3D als durchschnittliche Anzahl von T-Zellen innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle (Abb. 4a) und als maximale Anzahl von T-Zellen innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle (Abb. 4b). . Aufgrund der heterogenen Zelldichte in jedem Abschnitt/jeder Probe gab es große Unterschiede bei beiden Messungen über alle Proben hinweg. Insgesamt haben wir 10–70 % mehr T-Zellen innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle in 3D im Vergleich zu 2D quantifiziert. Beispielsweise hatten die Regionen 1 und 2 eine ähnliche maximale Anzahl an Immunzellen (n = 3) innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle in 2D und 3D, während Region 7 in 3D ein Maximum von 11T-Zellen und in 2D nur 3T-Zellen aufwies . Dieser Unterschied ist wichtig für Proben mit geringer Immunzelldichte, bei denen eine genaue Quantifizierung der Analyse räumlicher Beziehungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen in 2D schwieriger wäre. Die Diagramme der Immunzellclusterdichte in Abb. 4c – e veranschaulichen drei kontrastierende Beispiele von Hautregionen mit niedriger (Region 1), mittelhoher (Region 9) bzw. hoher (Region 12) Immunzellclusterdichte in 3D. Die niedrigen und hohen Beispiele können auf den Gesundheits-/Therapiestatus der Spender zurückgeführt werden, bei denen festgestellt wurde, dass sie an rheumatoider Arthritis (Region 1) und systemischem Lupus erythematodes (Region 12) leiden.

Die Konstruktion eines gefäßsystembasierten Koordinatensystems ist biologisch sinnvoll, da sich fast jede lebende Zelle in einem geringen Abstand zu einem Blutgefäß befinden muss (~25 µm bis 1 mm, je nach Gewebe), um Sauerstoff zu erhalten47. Es hat sich gezeigt, dass das Altern die Größe und Dichte der Blut- und Lymphgefäße in der Haut verringert und deren Struktur stört48. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der Endothelzellzahl, unabhängig vom Alter oder der Sonneneinstrahlung. Es gab signifikante Unterschiede zwischen 2D und 3D im durchschnittlichen Abstand der nächstgelegenen Endothelzelle zu Immunzellen (Makrophagen, T-Helfer, T-Killer und T-Regs), und die Abstände waren in 3D typischerweise kürzer (~56 µm in 3D gegenüber 108 µm). in 2D, (p < 0,0001) (Abb. 5a, b). Die Abstände zwischen jedem Immunzelltyp und Endothelzellen in 3D werden auch als Violindiagramme dargestellt und in Abb. 5c nach Alter und Sonneneinstrahlung für jeden Spender/jede Region gruppiert. Es gab einen Trend zu höheren Zahlen von T-Killerzellen innerhalb von 100 µm von Endothelzellen bei jüngeren Spendern (korr = –0,73, angepasster p-Wert = 0,08; siehe ergänzende Abbildung 7e). Die Auswirkungen hiervon sind ohne weitere Validierung in a unklar größere Gruppe von Probanden, kann aber altersbedingte Unterschiede in der adaptiven Immunantwort widerspiegeln. Ein Beispiel für eine Region mit höheren Gesamtimmunzellzahlen (einschließlich T-Killer) innerhalb von 100 µm von Endothelzellen ist in Abb. 5d dargestellt.

Die Gesamtzahl der p53-, Ki67- und DDB2-positiven Keratinozyten im 3D-Volumen und im Abstand zur Hautoberfläche wurde ebenfalls berechnet und die Verteilungen werden als Violindiagramme dargestellt (Abb. 6a). Die Voraussetzung für diese Analyse ist, dass eine höhere Anzahl von p53-geschädigten und/oder Ki67-positiven proliferierenden Keratinozyten in der oberen Epidermis oder in Richtung der Hautoberfläche ein Indikator für frühe präkanzeröse Läsionen ist. Wir haben die Abstände von p53-, Ki67- und DDB2-positiven Keratinozyten zur Hautoberfläche mithilfe von zwei verschiedenen Epidermismasken quantifiziert: (1) mithilfe des AE1-Zytokeratin-Cocktails, der spezifischer für die untere Epidermis/Stratum-Basalschicht und Haarfollikeleinheiten war; und (2) CK26-Cocktail, der die gesamte Epidermis sowie Haarfollikeleinheiten färbte. Aufgrund der Ungleichmäßigkeit der Hautoberfläche wurde die räumliche Zellabstandsanalyse mit einem Hybrid aus 3D- und 2D-Daten durchgeführt, wobei die Abstände der 3D-rekonstruierten Zellen zur Hautoberfläche anhand des nächstgelegenen 2D-Gewebeabschnitts berechnet wurden. Wir fanden heraus, dass die meisten Ki67- und p53-positiven Keratinozyten größtenteils in der AE1+/Stratum-Basalregion lokalisiert waren (wo regenerierende Keratinozyten-Stammzellen lokalisiert sind49). Bei der Analyse durch Sonneneinstrahlung oder Alterung gab es keine signifikanten Unterschiede im Abstand p53-, DDB2- und Ki67-positiver Keratinozyten zur Hautoberfläche. Bemerkenswerterweise gab es drei Fälle (Regionen 1, 2 und 9), die eine sehr breite räumliche Verteilung von p53- und Ki67-positiven Zellen aufwiesen (bis zu 1600 μm von der Hautoberfläche entfernt (ergänzende Abbildung 8a – c). In jedem Fall Dies war auf eine tiefer in die Dermis reichende Haarfollikeleinheit mit einer hohen Anzahl p53- und Ki67-positiver Zellen zurückzuführen. Es wurde gezeigt, dass sich die Anzahl p53-positiver Zellen bei älteren Patienten tiefer in die Haarfollikel und Drüsen erstreckte50 (diese Proben stammten aus …). Spender im Alter von 52–72 Jahren, wir haben jedoch zum Vergleich keine jüngeren Patienten verglichen.) In allen anderen Fällen betrug der durchschnittliche Abstand der p53- und Ki67-Zellen von der Hautoberfläche 155 bzw. 143 µm. Insgesamt Ki67- und p53-positiv Die Zellzahl korrelierte nicht signifikant mit dem Alter oder der Sonneneinstrahlung (ergänzende Abbildung 9). Dies stimmt mit früheren Studien überein, die zeigen, dass Ki67- und/oder p53-positive Zellen erst bei aktinischer Keratose (Schädigung der Keratinozyten im unteren Drittel der Epidermis) zunehmen Schicht) oder ein präkanzeröser/kanzeröser (volle Epidermisdicke) schuppenartiger in situ-Zustand erreicht wird22. Es gab eine signifikante umgekehrte Beziehung zwischen DDB2-positiven Zellen und dem Alter in der Stratum-Basale-Region der Epidermis (korr = –0,78, adj. p = 0,05, (ergänzende Abbildung 9e)) und der gesamten Epidermis (korr = –0,79 adj. p). = 0,04) Ergänzende Abbildung 9j). Angesichts der entscheidenden Rolle von DDB2 bei der Reparatur von Nukleotid-Exzisionen51 deutet dies auf eine verminderte Fähigkeit zur DNA-Reparatur mit zunehmendem Alter hin. Abbildung 6b, c zeigt Zelldaten aus zwei Beispielregionen von jüngeren und älteren Spendern mit leichter bzw. ausgeprägter Sonneneinstrahlung. Bemerkenswert ist, dass der jüngere Spender eine höhere Anzahl DDB2-positiver Zellen aufweist, die über 0–200 µm der Epidermis verteilt sind, und eine relativ niedrige Anzahl p53- und Ki67-positiver Zellen aufweist, verglichen mit dem älteren Spender, der fast das entgegengesetzte Profil aufweist (hohe Ki67- und p53- und p53-positive Zellen). niedrige DDB2-positive Zellen).

Wir haben einen Arbeitsablauf für die räumliche Registrierung multiplexierter Gewebedaten in drei Dimensionen mithilfe der HuBMAP-Registrierungsbenutzeroberfläche23 demonstriert. Interaktive Tools ermöglichen die Visualisierung räumlicher Muster von Zelltypen und -abständen in Bezug auf das Gefäßsystem und die Position innerhalb der Epidermis. Wir haben eine höhere Immunzelldichte und kürzere Abstände der wichtigsten Immunzellen zum nächstgelegenen Blutgefäß in 3D nachgewiesen, was ein auf Gefäßen basierendes gemeinsames menschliches Koordinatensystem unterstützt47. Die Antikörper wurden mit den anatomischen Strukturen der Haut, den Zelltypen und den Biomarker-Tabellen (ASCT + B) abgeglichen, um eine qualitativ hochwertige, ontologieorientierte Datengenerierung zu unterstützen. Während diese Erkenntnisse in gesunder Haut vorliegen, ist dieser 3D-Workflow auf andere Organe, Zelltypen und Krankheitszustände erweiterbar und bietet somit einen standardisierten Ansatz für die räumliche 3D-Analyse mit Zellauflösung und für den Aufbau eines menschlichen Referenzsystems. Alle Datensätze und Codes für die Segmentierung, Klassifizierung, Rekonstruktion und Datenvisualisierung sind frei verfügbar unter GitHub - hubmapconsortium/MATRICS-A: Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial -Analysis und über eine HuBMAP-Sammlung unter Samples | HuBMAP (hubmapconsortium.org).

Bei der Planung einer 3D-Rekonstruktion von Serienschnitten unter Verwendung gemultiplexter Immunfluoreszenzbilder sind mehrere experimentelle Designfaktoren zu berücksichtigen. Für größtmögliche Effizienz (Kosten/Zeit) haben wir 12 Proben in einen einzigen Paraffinblock eingebettet, was auch eine konsistente Färbung und Bildgebung aller Proben ermöglichte. Obwohl es einen gewissen Kompromiss hinsichtlich der verringerten zellulären Heterogenität (im Vergleich zu größeren ganzen Objektträgerabschnitten) gibt, wurde dies durch ein vielfältiges Spektrum an Proben aus einem breiten Altersbereich sowie durch Sonneneinstrahlungseffekte und anatomische Lage ausgeglichen. Die Blöcke wurden in 100 × 5 µm große Abschnitte geschnitten und 26 Abschnitte mit der höchsten Qualität wurden ausgewählt, basierend auf der korrekten Platzierung auf dem Objektträger und ohne visuelle Mängel wie Risse oder fehlendes Gewebe. Dies ist wichtig für Multiplex-Bildgebungsverfahren, bei denen das Deckglas zwischen den einzelnen Färbedurchgängen entfernt wird und zu einer Schädigung des Gewebes führen kann (unserer Erfahrung nach tritt ein Gewebeverlust typischerweise in den ersten 1–3 Färbedurchgängen auf, und insbesondere). wenn Proben aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit oder Schnittbildung kleine Risse aufweisen). Die Verwendung von Superfrost™-Objektträgern ist ein wichtiger Schutz vor Gewebeverlust, da das Gewebe stärker an der positiv geladenen Oberfläche des Objektträgers haftet. Zu den neueren kommerziellen Optionen für das Multiplexing gehört die Verwendung einer Durchflusszelle oder eines eindeckglasfreien Formats, sodass Gewebeverlust für zukünftige Arbeiten möglicherweise weniger besorgniserregend ist. Serienschnitte wurden alle in einer einzigen Charge mit gut charakterisierten Antikörpern gefärbt und lieferten qualitativ hochwertige, konsistente Bilder. Manchmal werden Quenching-Methoden verwendet, um das Signal in stark autofluoreszierenden Geweben zu reduzieren (z. B. wurde berichtet, dass die Behandlung mit Sudanschwarz B das AF-Signal im Pankreasgewebe um 60–95 % reduziert52). Wir haben jedoch kein Quenching verwendet, um das AF (Hintergrund/AF) zu reduzieren wird separat abgebildet und vom wahren Biomarkersignal abgezogen) und eine weitere Auswertung ist erforderlich, um festzustellen, ob das Löschen unseren AF-basierten Registrierungsworkflow negativ beeinflussen würde. Obwohl es von Abschnitt zu Abschnitt oder von Probe zu Probe eine inhärente Variation des AF-Signals gibt, gehen wir dieses Problem mit dem Otsu-Schwellenwertansatz an, der die Varianz innerhalb der Klasse verwendet, um den AF-Schwellenwert für jede Probe/jeden Objektträger festzulegen. Der AF-Schwellenwert wird automatisch von einem Serienabschnitt zum anderen angepasst, um die Trennung von Hintergrund und Vordergrund zu maximieren.

Wie bereits beschrieben, besteht eine Einschränkung der 3D-Rekonstruktion von Gewebeschnitten in der Einführung des „Bananeneffekts“, der gekrümmte anatomische Strukturen während der Registrierung fälschlicherweise begradigt. Die Mikro-CT-Bildgebung des Gewebeblocks vor dem Schneiden liefert ein Referenzvolumen, anhand dessen das 3D-rekonstruierte Volumen des Hautgewebes und der Zellen registriert wird. Ein ähnlicher Ansatz wurde auch erfolgreich auf ganze menschliche Gehirne angewendet, wobei MRT, Blockflächenfotografie (um die Lücke zwischen MRT und Histologie zu schließen) und dicke aufeinanderfolgende histologische Gehirnschnitte (25 µm dick) verwendet wurden17. Die posteriore Registrierung/Ausrichtung der 3D-rekonstruierten Volumina an Mikro-CT-Bildern ist wertvoll, wenn es während des zyklischen Färbeprozesses zu Verformungen und/oder Abnutzungen in den Gewebeproben kommt. Die Co-Registrierung ordnet Mikromerkmale (z. B. Zelltypen) Makro-Bildgebungsmerkmalen zu und im Vergleich zur histologischen 3D-Bildgebung mit Orientierungspunkten53 ist für eine genaue Registrierung und Rekonstruktion des 3D-Volumens nur ein minimaler manueller Eingriff erforderlich. In unserem Arbeitsablauf wird ein einzelner Objektträger des gesamten Volumens manuell anhand der Gewebequalität als Referenzbild identifiziert; Der weitere Prozess der Registrierung und 3D-Rekonstruktion erfolgt völlig automatisch. Im Vergleich zur auf Bildähnlichkeit basierenden Ausrichtung14,41 werden automatische Blockkorrespondenzen für die anfängliche affine Ausrichtung verwendet, was die Registrierungsgeschwindigkeit verbessert39,41 und auch lokale Verformungen berücksichtigt, die während des Färbe- und Bildaufnahmeprozesses auftreten können.

MATRICS-A wurde anhand von Hautproben ausgewertet, die an verschiedenen Körperstellen entnommen wurden, um die Vielfalt der anatomischen Organisation und Unterschiede in der Sonneneinstrahlung zu berücksichtigen. Die Kombination von 3D-rekonstruierten Zelldaten mit interaktiver Visualisierung lieferte mehrere Erkenntnisse, die bisher weder mit der 2D- noch mit der 3D-Volumenbildgebung der Haut durch Konfokal- oder LSFM gezeigt werden konnten. Wir zeigen, dass die T-Zellzahl in den 3D-rekonstruierten Volumina zwischen 500 und 2000 Zellen lag und auf geschätzte 15 bis 60 Millionen in 1 cm3 skaliert wurde. Unseres Wissens nach wurde die einzige vorherige Arbeit zur Quantifizierung des T-Zellen-Pools in der Haut in 2D von Ref. durchgeführt. 36, wo sie 20 Milliarden T-Zellen auf 1,8 m2 (durchschnittliche Hautoberfläche) schätzten. Eine wichtige Überlegung bei der Interpretation volumetrischer Immunzellzahlen ist die anatomische Lage der Hautprobe, die sich auf die Dicke der Keratinschicht sowie auf die Verteilung und Dichte von Adnexstrukturen wie Haarfollikeln und die kumulative Sonneneinstrahlung auswirkt. Um dies teilweise zu beheben, wurden unsere Proben aus der gesamten Anatomie, einschließlich Armen, Beinen, Bauch und Kopfhaut, entnommen und hinsichtlich Volumen und Endothelzellzahl normalisiert, um Unterschiede zwischen den Proben zu berücksichtigen. Ein ideales Studiendesign bestünde jedoch darin, prospektiv mindestens zwei unterschiedliche anatomische Proben desselben Spenders zu sammeln und die Rassenvielfalt zu erweitern, was im Rahmen zukünftiger Bemühungen zu HuBMAP geplant ist. Während unsere 3D-rekonstruierten Hautvolumina relativ klein sind (wir haben 100 × 5 µm-Schnitte verwendet und 26 × 5 µm-Schnitte heruntergewählt), entspricht dies der konfokalen Bildgebung, bei der die typische Bildtiefe 50–100 µm beträgt (bis zu 2 mm sind möglich). mit angepassten Clearing-Protokollen54), jedoch mit begrenzter Multiplexfähigkeit (4–5 Marker). Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) in Verbindung mit Clearing-Protokollen erreicht die höchste Bildtiefe (zwischen 1 mm3 und 1 cm3), und kürzlich wurde über Prostata- und Gehirnproben von bis zu 7 cm3 berichtet55. Allerdings bleibt die maximale Anzahl an Markern im Vergleich zum Multiplexing-Potenzial in dünneren Gewebeschnitten immer noch relativ gering (z. B. wurde kürzlich über die LSFM-Bildgebung von 9 Proteinen in 500 µm dicken, geklärten Hirnschnitten berichtet56). Es wird auch durch lange Inkubationszeiten der Antikörper eingeschränkt, um eine maximale und gleichmäßige Färbedurchdringung zu erreichen. Wir haben unseren Rekonstruktionsworkflow mit 26 Abschnitten demonstriert, aber eine größere Anzahl gemultiplexter Abschnitte ist technisch machbar und eher durch Kosten als durch technische Einschränkungen begrenzt. Weitere bei der 3D-Analyse zu berücksichtigende Faktoren sind die Bildauflösung, einschließlich der axialen Auflösung (Z-Dimension), die typischerweise 500–700 nm und 200–300 nm laterale Auflösung (XY-Dimension) bei 20-facher Vergrößerung in optischen Standardmikroskopen beträgt57. Markierungsfreie 3D-Bildgebungsmethoden können anatomische oder molekulare Informationen liefern, können jedoch Kompromisse bei der Auflösung mit sich bringen. Beispielsweise bietet die optische Kohärenzmikroskopie ein großes Sichtfeld, aber eine geringere Auflösung (1–15 µm); oder Raman-Mikroskopie liefert molekulare Informationen, aber die Auflösung ist beugungsbegrenzt und kann stärkere Anregungslaser erfordern, um das molekulare Signal im Verhältnis zur Hintergrundfluoreszenz und räumlichen Auflösung zu erhöhen57.

Trotz aller jüngsten Fortschritte in der 3D-Bildgebung steht nur eine begrenzte Anzahl frei zugänglicher Analysetools zur Verfügung58, was den Fortschritt bei der Interpretation von 3D-Daten behindert. Wir bieten Visualisierungstools für 3D-rekonstruierte Zelldaten, einschließlich räumlicher Zellabstandsanalyse und 3D-Zellclusterdichte. Diese bieten einzigartige Darstellungen von 3D-Zelldaten und zukünftige Iterationen könnten mit H&E-Bildern kombiniert werden, um die Tiefe zu erhöhen und mehr anatomischen Kontext bereitzustellen. Mithilfe herkömmlicher Balkendiagramme konnten wir 10–70 % mehr T-Zellen innerhalb von 30 µm einer T-Helferzelle in 3D im Vergleich zu 2D nachweisen, Cluster-Dichtediagramme visualisierten jedoch die Variationen der T-Zelldichte in 3D deutlicher. Diese Diagramme basieren auf 3D-Geodaten- und Bevölkerungsdichtekarten59 und kombinieren Streudiagramme und Heatmaps in einer 3D-Ansicht. Die Kombination dieser Diagramme ermöglicht es uns, uns auf das Verteilungsmuster jeder einzelnen Immunzelle zu konzentrieren und gleichzeitig die Gesamtverteilung zu beobachten. Wir gehen davon aus, dass 3D-Dichtediagramme (und Versionen davon) für den Bereich der 3D-Mikroskopie in gesundem, alterndem und erkranktem Gewebe immer wichtiger werden. Wir fanden signifikante Unterschiede im durchschnittlichen Abstand der nächstgelegenen Endothelzelle zu Immunzellen, wobei die Abstände in 3D halb so groß waren wie in 2D (~56 µm gegenüber 108 µm im Durchschnitt). Mit konfokaler Bildgebung, Lit. 18 zeigte, dass T-Zellen in der gesamten Dermis perivaskuläre Hüllen bilden und sich in einem Abstand von 15 µm zu Endothelzellen (in der Brusthaut) befinden. Tatsächlich fanden wir heraus, dass sich die meisten T-Zellen in allen Altersgruppen innerhalb von 25 µm von der nächsten Endothelzelle befanden, wir sehen jedoch auch einen größeren Bereich von Abständen bis zu 150 µm. p53- und Ki67-positive Keratinozyten waren größtenteils im Stratum basale lokalisiert, wo sich die Stammzellen befinden, aber der Abstand zur Hautoberfläche oder die Anzahl variierten nicht durch Alterung oder Sonneneinstrahlung. Zusammengenommen vertiefen diese räumlichen Metriken unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und der Nähe zu Gefäßen sowie den Auswirkungen von Alterung/Sonneneinstrahlung und eröffnen Möglichkeiten für weitere Anwendungen im Krankheitskontext und in anderen Organen. Zusätzliche Erkenntnisse werden durch die Einbeziehung zusätzlicher Marker für Alterung, Seneszenz, Immunität (z. B. Langerhans-Zellen), funktionelle Immunmarker (z. B. Erschöpfung oder Aktivierung60) und Entzündungsmarker gewonnen. Die Integration von scRNAseq- und räumlichen Transkriptomdaten aus denselben Proben wird die Komplexität von Hautzellpopulationen weiter analysieren und eine prospektive Probenentnahme und verschiedene Protokolle zur Probenkonservierung erfordern (was im Rahmen laufender HuBMAP-Organprojekte, einschließlich Haut, geplant ist).

Während die 2D-Raumanalyse aus Gründen der Zugänglichkeit und der Kosten für die meisten Forscher weiterhin die Methode der Wahl sein wird, ist es wichtig zu berücksichtigen, welche histologischen oder anatomischen Informationen in dünneren Gewebeschnitten minimiert werden oder verloren gehen, und die Probenentnahme entsprechend der Fragestellung zu planen /s wird gefragt. Wie kürzlich von Lit. gezeigt wurde. 12: 2D-Bilder ganzer Objektträger können ausreichen, um den Bereich der zellulären Interaktionen und Nachbarschaften innerhalb eines Tumors oder Organs (und besser als bei kleinen Gewebekernen) zu quantifizieren, aber um zelluläre Beziehungen in Bezug auf die anatomische Struktur und die Tumorentstehung zu verstehen, werden rekonstruierte 3D-Bilder bereitgestellt mehr Kontextinformationen. Zukünftige Lösungen könnten höherdimensionale 3D-Mikroskopie (konfokal/Lichtgeschwindigkeit) mit sequentiellen Schnitten aus benachbarten Geweberegionen kombinieren. Dies kann eine prospektive Gewebeentnahme mit sorgfältiger Auswahl der interessierenden Regionen für jede Modalität und eine vorausschauende Planung der Probenkonservierung erfordern. Aufgrund des Kosten-/Zeitaufwands für die Durchführung dieser Methoden und der Rechenanforderungen für die Analyse großer Datenmengen müssen einige Kompromisse eingegangen werden, z. B. könnte die 3D-Analyse auf kleinere, genau definierte Interessenbereiche innerhalb eines Organs beschränkt und kombiniert werden mit 2D-Daten der gesamten Folie. HuBMAP und die anderen Referenzkartierungsbemühungen bieten eine einzigartige Gelegenheit, 2D- und 3D-räumliche Zellanalysen über viele Organe hinweg durchzuführen und dabei standardisierte Methoden zur Gewebebildgebung, einschließlich räumlicher Protein- und Transkriptomikanalyse, in Kombination mit nichträumlichen Methoden wie scRNAseq zu verwenden. Dies wird den Grundstein für die Vertiefung unseres Verständnisses der Zelltypen und räumlichen Beziehungen im gesamten menschlichen Körper in 2D und 3D legen.

Hautbiopsien wurden von 12 Spendern im Alter von 32 bis 72 Jahren mit einer Mischung aus typischerweise UV-exponierten und nicht exponierten anatomischen Regionen entnommen (Ergänzungstabelle 1). Die Biopsien wurden zugeschnitten und in einen einzigen Block eingebettet, der einer Mikro-CT-Bildgebung unterzogen wurde. Die Blöcke wurden dann in fortlaufend nummerierte 100 × 5 µm-Serienschnitte unterteilt, von denen bis zu 26 der höchsten Qualität in serieller Folge für die weitere Analyse ausgewählt wurden (Dia-Layout mit virtuellen H&Es dargestellt – bestehend aus pseudofarbener Autofluoreszenz und DAPI61). in der ergänzenden Abbildung 1). Alle 12 Biopsien wurden mithilfe der HuBMAP-Registrierungsbenutzeroberfläche zusammen mit ihren entsprechenden Metadaten, einschließlich Spenderinformationen, einschließlich Gesundheitszustand und Probenverarbeitung, räumlich registriert (https://hubmapconsortium.github.io/ccf-ui/rui/ – ergänzende Abbildung 2). ). Von den 12 Proben wurden zehn zur weiteren statistischen Analyse heruntergewählt. Zu den beiden ausgeschlossenen Proben gehörte ein Spender mit einer gutartigen Zyste, der jedoch im Vergleich zu anderen Proben eine ausgeprägte Entzündung und Immunzellinfiltration aufwies (Region 6). Die zweite Probe wies eine Narbe auf, die auch die normale Organisation der Epidermis- und Dermisschichten (Region 12) veränderte. Alle Spender waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme in gutem Gesundheitszustand und krebsfrei, wobei zwei Spender an chronischen Krankheiten (RA und HIV) litten, was in der Patientenübersichtstabelle (Ergänzungstabelle 1) vermerkt ist. Alle Patienten stimmten der Bereitstellung von Proben für Forschungszwecke zu und die einschlägigen ethischen Vorschriften wurden befolgt. Das Studienprotokoll wurde vom IRB der University of Pittsburgh genehmigt (STUDY19120023).

Virtuelle H&E-Bilder (bei denen es sich um pseudofarbene Autofluoreszenz- und DAPI-Bilder61 handelt) von jedem Spender wurden von einem Pathologen auf histopathologische Veränderungen im Zusammenhang mit chronischer Sonneneinstrahlung wie keratinozytäre Atypien in der Epidermis und Grad der Veränderungen der solaren Elastose in der Dermis untersucht. Dementsprechend wurden die Proben in Hautgruppen mit leichten, mittelschweren und ausgeprägten chronischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Sonneneinstrahlung eingeteilt (Ergänzungstabelle 1 und virtuelle H&E für zwei kontrastierende Regionen (leichte vs. ausgeprägte Sonneneinstrahlung) in der ergänzenden Abbildung 10a, b). . Spender in der Gruppe mit leichter chronischer Sonnenexposition waren signifikant jünger als die Spender mit mäßiger Sonnenexposition (42,4 vs. 62,2 Jahre, p = 0,008). Alle virtuellen H&E-Images befinden sich unter: vccf-visualization-release/vheimages im Hauptverzeichnis · hubmapconsortium/vccf-visualization-release · GitHub

Zur Erstellung hochauflösender CT-Bilder der 12 Hautproben innerhalb des Gewebeblocks wurde ein Phoenix-Mikro-CT-System (GE, Wunstorf, Deutschland) mit bis zu 300 kV/500 W verwendet. Beispielbilder für den Mikro-CT-Workflow mit entsprechendem histologischen Schnitt sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt. Phoenix-Mikro-CT-Scanner verfügen über ein hochdynamisches digitales DXR-Detektorarray und können isotrope Bilder von 1 μm erzeugen und werden häufig für die industrielle Prozesskontrolle sowie für verwendet wissenschaftliche Forschungsanwendungen. Aufgrund der Doppelrohrkonfiguration können detaillierte 3D-Informationen für einen extrem breiten Probenbereich bereitgestellt werden. Für unsere Zwecke erwies sich ein Strom von 200 kV als optimal im Hinblick auf das Signal-Rausch-Verhältnis, um qualitativ hochwertige volumetrische isotrope Bilder mit einer Auflösung von 0,016 mm für die eingebetteten Hautproben zu erzeugen, und dies ermöglichte auch die Abbildung von 12 Proben in einem Block innerhalb 30 Minuten. Der DICOM-Header mit Bildgebungseinstellungen ist in der Ergänzungstabelle 5 dargestellt.

Alle in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden einem standardisierten Charakterisierungsprozess unterzogen, der von unserem Labor entwickelt und seit über einem Jahrzehnt für über 500 kommerzielle Antikörper implementiert wird28. Wir beginnen die Charakterisierung typischerweise mit einem Referenz-Multiorgan-TMA (MTU391, Pantomics), das 15 Hauptkrebsarten (chirurgisch reseziert) und entsprechende unbeteiligte Gewebe als Kontrollen enthält. Die für die Referenz-TMA verwendeten Proben werden typischerweise 24 Stunden lang in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert und unter Verwendung identischer SOPs verarbeitet. Um eine konsistente Färbung in neuen Chargen, Klonen oder Konjugaten sicherzustellen, werden alle Antikörper erneut auf MTU391-Arrays getestet (je nach Zeitpunkt kann es sich dabei um unterschiedliche Spenderproben, aber dasselbe Organformat) handeln. Die MTU391-Arrays werden auch zur Optimierung der Konzentration und zum Testen verwendet, ob die Farbstoffinaktivierungslösung negative Auswirkungen auf die Proteinepitope hat. Die anfängliche Charakterisierung und Herunterauswahl umfasst (1) das Screening mehrerer Klone/Ziele, die mit dem immunhistochemischen Nachweis in FFPE-Gewebe kompatibel sind (unter Verwendung veröffentlichter Literatur und des Human Protein Atlas62); (2) Bewertung der Leistungsspezifität mithilfe des MTU391-Arrays und der Isotypkontrolle mithilfe eines markierten Sekundärantikörpers; (3) Um die Epitopstabilität gegenüber dem Multiplex-Cycling-Prozess zu bestätigen, werden ungefärbte MTU391-Objektträger mehreren Signalinaktivierungsrunden unterzogen und dann gefärbt, um zu bewerten, ob die Zielintensität abgenommen hat. In dieser Studie zeigte keines der Epitope eine Empfindlichkeit gegenüber dem Signalinaktivierungsprotokoll (dh die Färbungsintensität nahm nach der Inaktivierung nicht ab); (4) Die leistungsstärksten Antikörper wurden in mehreren Farbstoff-Protein-Verhältnissen an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert und auf aufeinanderfolgenden MTU391-TMA-Schnitten titriert, um Empfindlichkeit und Spezifität mit dem unmodifizierten Primärantikörper zu vergleichen. Der primäre Sekundärnachweis kann auch in der ersten Färberunde verwendet werden (vorausgesetzt, es stehen verschiedene Arten zur Verfügung), was Flexibilität für alle Antikörper bietet, die nicht erfolgreich konjugiert werden können. Für die aktuelle Studie wurden alle Antikörper wie beschrieben in MTU391-Arrays getestet und dann in einer Pilotstudie mit zehn Hautproben, die von der Abteilung für Dermatopathologie der U. Pitt bereitgestellt wurden, erneut getestet. Ergänzende Tabelle 3 zeigt die in der Studie verwendeten Antikörperklone und -konjugate. Das 18-Marker-Panel deckte 14 Zelltypen ab: Keratinozyten (körnig, stachelig, basal), Epithelzellen, Fibroblasten, Immunzellen (Makrophagen, T-Helfer, T-Killer, T-Reg), Nervenzellen, Myoepithelzellen und Endothelzellen. Diese werden auch mithilfe der Reportervergleichsfunktion HuBMAP Anatomical Structures Cell Type and Biomarkers (ASCT + B) https://hubmapconsortium.github.io/ccf-releases/v1.0/docs/asct-b/skin.html hervorgehoben. Die in der ergänzenden Abbildung 11a–r gezeigten Beispiele zeigen repräsentative Färbungen sowohl auf dem MTU391-Gewebe-Array als auch auf Hautgewebe. Alle Antikörper zeigten eine gute Färbespezifität in der Haut, mit Ausnahme von UCHL1 (Nervenmarker), der zusätzlich zur spezifischen Nervenfärbung eine hohe Hintergrund-/unspezifische Färbung aufwies (ergänzende Abbildung 11r).

Die Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung (MxIF) und die Bildgebung der Hautproben wurden wie in den Referenzen beschrieben durchgeführt. 61,63 mit der Cell DIVE™-Technologie (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Objektträger auf Superfrost™ (Thermo Fisher) geschnitten werden, was für die Minimierung des Gewebeverlusts während des Zyklusvorgangs von entscheidender Bedeutung ist. Nach der Objektträgerreinigung und einem zweistufigen Antigen-Retrieval-Prozess63 wurden die FFPE-Objektträger mit DAPI gefärbt und in allen interessierenden Kanälen abgebildet, um die Hintergrundautofluoreszenz (AF) des Gewebes zu erfassen. Darauf folgte eine primäre/sekundäre und/oder direkte konjugierte Antikörperfärbung von bis zu zwei Markern pro Runde plus DAPI, Farbstoffinaktivierung und ein wiederholter Zyklus für alle 18 Biomarker. Jede Probe hatte etwa 40 20-fache Sichtfelder (FOV) und bis zu 26 Schnitte wurden in einzelnen Chargen gefärbt (mit dem Leica Bond) und bildgebend (IN Cell Imager 2200), um die Konsistenz sicherzustellen. Als technische Kontrolle war auch ein MTU391-Objektträger (oben beschrieben) enthalten. Die Bildgebungssoftware Cell DIVE ermöglicht die Bildverarbeitung in Echtzeit (Registrierung, AF-Subtraktion und Beleuchtungskorrektur während jeder Bildgebungsrunde). Multiplexbilder wurden automatisch registriert und für die Autofluoreszenz-Subtraktion (AF)61,64 und die Beleuchtungskorrektur (weiter unten ausführlicher beschrieben) verarbeitet.

Da jede Hautprobe im Block aus mehreren FOVs (bis zu 40) bestand, war eine Bildzusammenfügung über einen großen Bereich erforderlich. Eine inhärente Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung kann zu „Quilting“-Artefakten führen, bei denen die Grenzen einzelner Bildfelder in Kombination mit benachbarten Feldern deutlich erkennbar erscheinen. Um diese inhärente Ungleichmäßigkeit zu korrigieren, haben wir mehrere Erstkalibrierungen durchgeführt. Im ersten Schritt durchlaufen wir alle Objektive/Filter, während wir einen standardmäßigen leeren Glasobjektträger abbilden. Der Fokus wird mithilfe eines Hardware-Laser-Autofokussierers bestimmt, der Teil des Cell DIVE-Bildgebungssystems ist. Wir machen Bilder des leeren Glases mit langen Belichtungszeiten und verwenden diese Bilder anschließend, um eventuell im System vorhandene Glitzereffekte oder Reflexionen zu entfernen. Im zweiten Schritt fotografieren wir eine Reihe fluoreszierender Kunststoffobjektträger (Ted Pella Fluoreszenzreferenz, Nr. 2273). Auch hier durchlaufen wir alle Objektiv-/Filterkombinationen und bilden das Fluoreszenzobjekt ab, das dem Emissionspeak eines bestimmten Filtersatzes am nächsten liegt. Bevor wir jedes dieser Bilder verarbeiten, subtrahieren wir das entsprechende Bild des Hintergrundglases (dh für dasselbe Objektiv/Filter und mit einer Intensität, die durch das Verhältnis der Belichtungszeiten skaliert wird). Wir erhalten dann ein Bild, das nominell einheitlich sein sollte, aber stattdessen die Uneinheitlichkeit dieses Filters oder Ziels anzeigt. Anschließend verwenden wir eine Anpassungsfunktion, um eine Reihe von Parametern zu berechnen, die die Ungleichmäßigkeit charakterisieren (einschließlich der Bestimmung des tatsächlichen Beleuchtungszentrums). Diese Parameter werden gespeichert und für die nachfolgende Bildgebung subtrahieren wir zunächst ein ordnungsgemäß skaliertes Hintergrundglasbild und dividieren dann die Ungleichmäßigkeit mithilfe der vorab festgelegten Koeffizienten.

DAPI-Bilder werden vor der Kernsegmentierung in unserem Deep-Learning-Framework auf mittlere Einheitsvarianzwerte von Null normalisiert. Zweitens wurden die einzelnen ganzen Objektträger vor der Schätzung der Biomarker-Wahrscheinlichkeiten mithilfe von GMM zwischen dem Mittelwert Null und der Einheitsstandardabweichung normalisiert. Durch die bildspezifische Normalisierung des gesamten Objektträgers wird sichergestellt, dass alle Bilder relativ zu ihrer Intensitätsverteilung skaliert wurden, und die häufig zwischen Serienbildern beobachtete Intensitätsvariabilität verringert. Durch die Kombination dieser beiden Normalisierungen wurde sichergestellt, dass eine einzelne Zelle auf der Grundlage des relativen Intensitätsunterschieds zwischen dem Biomarker und dem Hintergrund segmentiert wurde und nicht auf der Grundlage der absoluten Intensitätsverteilung, die von Objektträger zu Objektträger variieren und sich negativ auf die Segmentierungsgenauigkeit auswirken kann.

Abbildung 2 und die ergänzende Abbildung 5a, b fassen unser Segmentierungsmodell-Framework zusammen. Zunächst wurde ein Encoder-Decoder-basiertes Deep-Learning-Modell (DL)65 an einer kleinen Stichprobe (194 DAPI-Bildfelder, ausgewählt aus 30 Bildern von zehn Patienten) manuell annotierter Kerne trainiert, die mit der Annotationsfunktion in QuPATH66 erstellt wurden. Multiscale Laplace of Gaussian (LOG) wurde zusammen mit den DAPI-Bildern als separate Kanäle in unser Encoder-Decoder-basiertes DL-Modell eingeführt. Die LOG-Funktion erkennt Blob-ähnliche Strukturen (die der Kernform und -grenze entsprechen) in den DAPI-Bildern und stellt dadurch Kontextinformationen für das DL-Modell bereit. Durch die Verwendung mehrerer Kanäle konnten wir anhand einer kleinen Stichprobe der manuell kommentierten DAPI-Bilder ein genaues DL-Modell trainieren. Die Tiefe des Encoder-Decoder-DL-Modells wurde auf 4 eingestellt und die binäre Kreuzentropie wurde als Verlustfunktion verwendet. Anschließend wurde ein unbeaufsichtigtes GMM zur automatischen probabilistischen Segmentierung von Immunzelltypen verwendet: T-Killer (CD8), T-Reg (FOXP3), T-Helfer (CD4), Makrophagen (CD68) sowie Endothelzellen (CD31), Marker der Proliferation (Ki67), DNA-Schaden (p53) und DNA-Reparatur (DDB2) (Ergänzende Abbildung 5b). GMM erzeugt konstruktionsbedingt eine probabilistische Segmentierung für Zellen und funktionelle Biomarker, bei denen es sich um kontinuierliche Wahrscheinlichkeitswerte zwischen 0 und 1 (d. h. 0,2, 0,3, 0,4 usw.) handelt. Anschließend wird ein Schwellenwert angewendet, um eine binäre Klassifizierung zu erstellen. Da Wahrscheinlichkeitswerte direkt mit der Signalintensität korrelieren, hätte ein hoher Ausdruck einen Wahrscheinlichkeitswert nahe 0,9. GMM mit zwei Clustern wurde verwendet, um eine probabilistische Segmentierung des Zelltyps/der Zellmarker und des Hintergrunds zu erhalten. Pixeln mit hohem Signal für Zelltyp und Funktionsmarker wurden automatisch hohe Wahrscheinlichkeitswerte in einem Cluster (positive Klasse) zugewiesen, und Pixeln mit niedriger Signalintensität wurden im zweiten Cluster (Hintergrund – negative Klasse) hohe Wahrscheinlichkeitswerte zugewiesen. Anschließend wurden die aus der positiven Klasse des GMM-Modells und der Kernsegmentierung (aus dem DL-Modell) erhaltenen Vereinigungen von Wahrscheinlichkeiten fusioniert. Wahrscheinlichkeitswerte wurden verwendet, um positive Zellen automatisch zu skalieren (zwischen 0–1) und zu quantifizieren (dh für jeden interessierenden Marker) und die prozentuale Überlappung zwischen den Markern und den segmentierten Kernen zu bestimmen. Darüber hinaus wurde eine geringe prozentuale Überlappung verwendet, um Bildartefakte, Ablagerungen und Zellen mit geringer/Hintergrundmarkierungsintensität zu entfernen. Das gleiche GMM wurde verwendet, um zusammenhängende Strukturen automatisch zu segmentieren, unabhängig von Kernen, wie z. B. Blutgefäße (basierend auf CD31-Färbung) und Epithelmasken (basierend auf AE1- und CK26-Cytokeratin-Cocktail-Färbung). In diesem Szenario verlassen wir uns auf Wahrscheinlichkeiten, die wir von unserem GMM erhalten, und schwellen die Biomarker-Wahrscheinlichkeiten mithilfe von Otsu-Filtern automatisch an67. Der gesamte Code ist auf GitHub zu finden – hubmapconsortium/MATRICS-A: Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial -Analysis. Der Docker-Container/die Docker-Umgebung zum Ausführen des Codes kann mithilfe von docker pull hubmap/gehc:skin abgerufen werden. Testdaten für Hautregion 7 finden Sie unter Human Digital Twin: Automated Cell Type Distance Computation and 3D Atlas Construction in Multiplexed Skin Biopsies | Zenodo. Es gibt eine entsprechende ReadMe-Datei, die Kontext und Anweisungen für den Inhalt des Repositorys bereitstellt und hier MATRICS-A/README.md unter main · hubmapconsortium/MATRICS-A · GitHub zu finden ist.

Zur Validierung des Zellklassifizierungsansatzes wurden insgesamt 2722 positive und negative Zellmarker mithilfe der Annotationsfunktion in QuPATH66 manuell annotiert. Die Aufschlüsselung der Anmerkungen ist wie folgt: CD3: 408; CD4: 281; CD8: 347; FOXP3: 360; CD68: 391, CD31: 352; Ki67: 150; S. 53: 164; DDB2: 162. Diese Datensätze wurden dann verwendet, um die Empfindlichkeit, Spezifität und Genauigkeit der Zellklassifizierung zu berechnen (Abb. 2e).

For 3D reconstruction a reference AF image was manually identified from 24 serial sections of every region based on image quality (contrast, wear and tear, deformation etc.). All 2D AF images were masked (with a tissue mask) and all 2D AF serial section images were registered to the chosen reference image. Otsu thresholding uses intra-class variance computed from image histogram to set the thresholds for the AF background and the foreground. Hence while the AF signal distribution may change from one serial section to another, the threshold is set based on intra-class variance and is automatically adjusted from one serial section to another to maximize the separation of the background and the foreground. Our registration model uses local patch-based, normalized cross correlation to establish correspondences making our model fast without compromising on accuracy. Patch wise normalized cross correlation depends less on absolute intensity values and depends more on a good separation of the background and foreground signal which we obtain by masking our autofluorescence image. After affine registration, B-spline based deformable registration68, we use normalized mutual information to mitigate image intensity differences that may occur between one serial section to another in the autofluorescence images. A block matching strategy69 was adopted to determine the transformation parameters for the affine registration from masked AF images (Fig. 3c). The similarity between a block from the reference AF was computed relative to the AF serial sections. The best corresponding block defined the displacement vector for the affine transformation70. Normalized mutual information was chosen as the similarity matrix and maximized to achieve the registration. The transformation map obtained from the registration of the AF images was applied to individual biomarkers for all serial sections to create a 3D volume of endothelial, T killer, T reg, T helper cells and macrophages (Fig. 3d) and overlaid on 3D AF volume as shown in Fig. 3e. Post registration, 3D connectivity of all cells were used to fuse overlapping cells in adjacent serial sections to prevent overcounting. Cells overlapping in 3D in adjacent sections are automatically connected and considered as a single entity in 3D using ITK’s 3D connected filterClass Template Reference. https://itk.org/Doxygen/html/classitk_1_1ConnectedComponentImageFilter.html (2023)." href="/articles/s42003-023-04991-z#ref-CR40" id="ref-link-section-d87231388e1796"> 40. ITK ist eine Open-Source-Software, die sowohl für die 2D- als auch für die 3D-Analyse medizinischer Bilder weit verbreitet ist. Der 3D-Verbindungsfilter von ITK wird verwendet, um binäre Beschriftungen in 3D basierend auf der Überlappung der Beschriftungen in 3D (benachbarte Abschnitte nach der 3D-Rekonstruktion) zusammenzuführen. Während der Watershed-Algorithmus häufig zum Zusammenführen von Beschriftungen in 3D verwendet wird, erfordert er die manuelle Abstimmung mehrerer Parameter (Diffusion, Gradient, Schwellenwert) für einen Datensatz, der sich in einem großen Datensatz wie unserem möglicherweise nicht verallgemeinern lässt. Dies würde zur Verschmelzung nicht verwandter Zellen (aufgrund des Diffusionsparameters) oder zum Zellabfall (aufgrund des Gradientenschwellenwertparameters) führen. Stattdessen wurde ein Filter für verbundene Komponenten verwendet, um segmentierte Zellen, die lokal in 2D verbunden sind, zusammenzuführen, um eine einzelne Einheit für jede Zelle zu erstellen. Hier erweitern wir dieses Framework auf 3D. Für diesen Ansatz mit verbundenen Komponentenfiltern ist keine manuelle Abstimmung der Parameter erforderlich, und die 3D-verbundenen Filter von ITK werden routinemäßig in der medizinischen Bildanalyse eingesetzt. Der gesamte Code ist auf GitHub zu finden – hubmapconsortium/MATRICS-A: Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial -Analysis. Der Docker-Container/die Docker-Umgebung zum Ausführen des Codes kann mithilfe von Docker Pull Hubmap/gehc:skin und Testdaten abgerufen werden für Hautregion 7 finden Sie unter Human Digital Twin: Automated Cell Type Distance Computation and 3D Atlas Construction in Multiplexed Skin Biopsies | Zenodo. Es gibt eine entsprechende ReadMe-Datei, die Kontext und Anweisungen für den Inhalt des Repositorys bereitstellt und hier MATRICS-A/README.md unter main · hubmapconsortium/MATRICS-A · GitHub zu finden ist.

Zum Vergleich auf Patientenebene wurden die Zellzahlen innerhalb der interessierenden Regionen (entweder die gesamte abgebildete Probe oder auf die Epidermisregion in 3D-rekonstruierten Daten beschränkt) auf Patientenebene für jeden Zelltyp aggregiert (n = 10 unabhängige Datensätze für die statistische Analyse). Anschließend wurden die Zellzahlen anhand des Volumens des interessierenden Bereichs normalisiert, um Unterschiede in der Probengröße zu berücksichtigen. Die Anzahl der Voxel im 3D-Volumen wurde automatisch mithilfe der Software Insight Toolkit (ITK)41 ermittelt. Unter Verwendung der auf Spenderebene aggregierten normalisierten Zellzahlen wurden statistische Hypothesentests durchgeführt, um die Korrelation zwischen der normalisierten Zellzahl und dem Alter oder der UV-Exposition zu verstehen. Um die Korrelation mit dem Alter zu messen, wurde die Korrelation nach Spearman quantifiziert und getestet (zweiseitig). Für die UV-Exposition (leicht vs. mäßig ausgeprägt) wurde ein zweiseitiger Wilcoxon-Test durchgeführt. Für beide statistischen Tests wurde die Mehrfachtestkorrektur von Benjamini & Hochberg angewendet71. Die statistische Analyse wurde mit R Version 4.1.2 durchgeführt und zusätzliche Pakete reshape (0.8.9), ggplot2 (3.3.6) und plyr (1.8.7) wurden für die Datenverarbeitung und Visualisierung verwendet.

Zur Visualisierung der Zellabstandsdaten (d. h. des Abstands der Immunzellen von den nächstgelegenen Endothelzellen (Abb. 5c) und des Abstands der UV-Schadensmarker von der Hautoberfläche (Abb. 6a)) wurden auch Violindiagramme einbezogen. Diese kombinieren ein Boxplot und ein Dichtediagramm um die Wahrscheinlichkeitsdichte der Daten bei verschiedenen Werten anzuzeigen. Der Interquartilbereich wird durch das Kästchen in der Mitte dargestellt, und die verlängerte Linie über/unter dem Kästchen zeigt die oberen (maximalen) und unteren (minimalen) benachbarten Werte an. Der Medianwert Der Abstand wird durch die Linie in der Mitte des Kastens dargestellt. In der interaktiven Online-Version wird auf jeder Seite des Kastens eine Kerndichteschätzung angezeigt, um die Verteilungsform der Abstände von Makrophagen (CD68+) und T-Helferzellen zu zeigen (CD3+ CD4+), T-Reg-Zellen (CD3+ CD4+ FOXP3+) und T-Killerzellen (CD3+ CD8+) zur nächstgelegenen Endothelzelle für jeden Spender https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/violin_cell.html. Die Summe aller Immunzellen gruppiert nach Sonneneinstrahlung wird ebenfalls angezeigt: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/violin_cell_all_region.html.

Ähnliche Diagramme wurden für den Abstand von Ki67-, p53- und DDB2-positiven Zellen zur Hautoberfläche für zwei Regionen erstellt, die mit zwei verschiedenen Zytokeratin-Cocktails gefärbt wurden: AE1+-Zellen (stärker im Stratum basale der Epidermis lokalisiert) und PCK26+-Zellen (die am stärksten färbten). der gesamten Epidermis). Beide Zytokeratin-Cocktails färbten Zellen, die mit Drüsenstrukturen und Haarfollikeln in der Dermis assoziiert sind.

Distanzdiagramme für p53+-, Ki67+- und DDB2+-Zellen in der AE1+/Stratum basale-Epidermis-Region befinden sich in:

https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis/violin_damage_all_region_epidermis.html und in

https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis/violin_damage_epidermis.html.

Distanzdiagramme für p53+-, Ki67+- und DDB2+-Zellen in der PCK26+/gesamten Epidermisregion befinden sich in:

https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis_entire/violin_damage_all_region_epidermis.html und in:

https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis_entire/violin_damage_epidermis.html

Es wurden zwei Arten von Distanzanalysen durchgeführt: (1) der Abstand zwischen dem Schwerpunkt der Immunzellkerne (Makrophagen, T-Helfer, T-Killer und T-Reg) und dem Rand des nächstgelegenen Blutgefäßes (Endothelzelle) und (2) der Abstand zwischen dem Schwerpunkt der Zellen, die positiv für UV-Schadens- und Reparaturmarker (p53 und DDB2) und Proliferation (Ki67) sind, und dem nächstgelegenen Rand der Hautoberfläche. Um die Entfernungsberechnungen für die 13.489 Immunzellen und 12.407 Schadens-/Proliferationsmarker in den zehn 3D-Regionen zu beschleunigen, wurde ein Filter angewendet, um die Quadratwurzel der Entfernung nur für diejenigen Zellen/Marker zu berechnen, die im Bereich des aktuellen Mindestwerts lagen des Abstands (d. h. Zellen/Marker, deren Abstand auf der x-, y- oder z-Achse größer als der aktuelle Mindestabstand ist, werden nicht in die Abstandsberechnung einbezogen). Dieser Ansatz reduzierte die Laufzeit und Speicherlast erheblich.

Interaktive 3D-Visualisierungen von Zell- und Biomarkerabständen wurden mit dem Plotly 3D-Visualisierungspaket implementiert, siehe Abb. 5c. Für Ki67-, p53- und DDB2-Marker innerhalb der Epidermis und Entfernung zur Hautoberfläche: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/epidermis/; für Abstände von Immunzellen zu Blutgefäßen in der Dermis: https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/. Das Ergebnis der Distanzberechnung wurde auf zwei Arten visualisiert: (1) eine 3D-Ansicht, die alle Immunzellkerne, Schadens-/Proliferationsmarker, Blutgefäße und ihre kürzesten Distanzen (Linien) im Geweberaum projiziert; und (2) die Histogramme, die die Verteilung der Abstände zwischen Kernen und Blutgefäßen sowie zwischen Schadens-/Proliferationsmarkern und der Hautoberfläche zeigen. Die Visualisierung von Distanzlinks wurde durch das Hinzufügen unsichtbarer Links optimiert, die alle vorhandenen Links in einer einzigen Polylinie vereinen, wodurch die Größe der Vektordaten und der Speicherverbrauch reduziert werden, was eine reaktionsfähige Online-Interaktion mit etwa 20.000 Knoten in einem Webbrowser ermöglicht. In der 3D-Ansicht wird jeder Zellkern als kleiner Kreis in der 3D-Visualisierung dargestellt, während jeder UV-Schadens-/Proliferationsmarker als Kreuz dargestellt wird (siehe Legende für Farben der Zell- und Biomarkertypen). Endothelzellen (basierend auf CD31-Färbung) werden als Ansammlung roter Kreise dargestellt. Die äußerste Hautoberfläche jedes Gewebeabschnitts wird grau dargestellt. Der Schieberegler in der oberen rechten Ecke jeder 3D-Ansicht ermöglicht es dem Benutzer, jede Gewebeschicht separat anzuzeigen. Das Histogramm liefert Informationen über die Verteilung der Entfernungen zur weiteren Analyse. Die kurzen Linien unter den Histogrammen zeigen die Beziehung zwischen allen Proben und den Histogrammbalken an. Das Histogramm kann in drei verschiedenen Layouts angezeigt werden: Überlagert (standardmäßig), gestapelt oder gruppiert, siehe Auswahlschaltfläche unten links. Die Visualisierungen können als HTML-Datei zur Online-Präsentation und Erkundung oder als Vektorbild zur statischen Anzeige exportiert werden.

Diese 3D-Visualisierung veranschaulicht die Verteilung von Immunzellclustern, siehe interaktive Version unter https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-release/html/immune_cluster/. Es zeigt die Anzahl der Immunzellen, die in einem einstellbaren Radiusbereich vorhanden sind, hier zeigen wir beide 15 30 µm. Die Immunzellcluster-Ansicht ermöglicht die Identifizierung von Bereichen mit hoher Immunzelldichte durch die Verwendung von Heatmap-ähnlichen Blasen unterschiedlicher Größe und Farbe. Große, gelbe Blasen weisen auf eine hohe Dichte an Immunzellen hin, während kleine, dunkelblaue Blasen auf eine geringere Dichte hinweisen. Der Farbbalken auf der rechten Seite der Ansicht dient als Legende und hilft dem Leser, die Dichte der Verteilung zu erkennen. Mit dem Schieberegler in der oberen rechten Ecke der Visualisierung kann der Benutzer die Clusteransicht für jede Gewebeschicht einzeln anzeigen und die 3D- und 2D-Ansichten zur weiteren Analyse vergleichen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die anonymisierten Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in Zenodo https://zenodo.org/record/7565670#.ZDbF_ObMIuV (Original-Einzelzellendaten für interaktive Diagramme – Quelldaten für Abb. 4C–E; Abb. 5C) enthalten , D; Abb. 6A–C. Ergänzende Abb. 8A–C) und als herunterladbare Datei aus diesem Dokument – ​​Ergänzende Daten 1 – Quelldaten für Abb. 5A; Ergänzende Abbildungen. 6, 7 und 9. Alle Originalbilder für jeden Spender/jede Region/sequentiellen Abschnitt sind über öffentlich zugängliche HuBMAP Globus-Sites für jeden Spender/jede Region verfügbar https://hubmapconsortium.github.io/vccf-visualization-2022/.

Der gesamte MATRICS-A-Code ist auf GitHub zu finden – hubmapconsortium/MATRICS-A: Multiplexed Image Three-D Reconstruction and Integrated Cell Spatial -Analysis (https://github.com/hubmapconsortium/MATRICS-A). Es gibt eine entsprechende ReadMe-Datei, die Kontext und Anweisungen für den Inhalt des Repositorys bereitstellt und unter MATRICS-A/README.md unter main · hubmapconsortium/MATRICS-A · GitHub zu finden ist. Der Docker-Container/die Docker-Umgebung zum Ausführen des Codes kann mithilfe von Docker Pull Hubmap/gehc:skin abgerufen werden. und Testdaten für Hautregion 7 finden Sie unter https://zenodo.org/record/7565670#.ZDbF_ObMIuV. Zur Erstellung der Docker-Container-Umgebung und zum Erstellen des Codes wurden mehrere Open-Source-Software verwendet, darunter ITK (Version 5.1), Tensorflow (Version 1.15), Keras (Version 2.2.4), opencv-python (Version 3.4), Tifffile (Version 2020.9), Nifty-Reg (Version 1.3), Python (Version 3.6), CMake (Version 3.17). Wir empfehlen dringend, den Docker-Container zum Ausführen des Codes zu verwenden. Der gesamte VCCF-Code ist unter https://github.com/hubmapconsortium/vccf-visualization-2022 verfügbar.

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Diese Arbeit wurde durch NIH Award No. 5UH3CA246594-03 (FG), OT2OD026671 und OT2OD033756 (KB) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Soumya Ghose, Yingnan Ju.

GE Research Center, 1 Research Circle, Niskayuna, NY, 12309, USA

Soumya Ghose, Elizabeth McDonough, Chrystal Chadwick, Sanghee Cho, Rachel Rose, Alex Corwin, Christine Surrette, Jessica Martinez, Eric Williams, Anup Sood, Yousef Al-Kofahi und Fiona Ginty

Indiana University, 107 South Indiana Ave, Bloomington, IN, 47405, USA

Yingnan Ju & Katy Borner

Medizinische Fakultät der Universität Pittsburgh, 3550 Terrace St, Pittsburgh, PA, 15213, USA

John Ho, Arivarasan Karunamurthy und Louis D. Fallo Jr

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FG, KB, SG, YJ, JH, AS, YA-K., LDF und AK haben die Studie konzipiert. EMD, CC, JM, EW und CS führten die experimentellen Arbeiten im Zusammenhang mit der Antikörpervalidierung, dem Multiplexing und der Datenqualitätskontrolle durch. AC, EMD und CS waren für die Bildgebungsabläufe sowie die Qualität und Kuratierung der Bilddaten verantwortlich. RR führte eine Mikro-CT-Analyse der Gewebeproben durch. JH, AK und LDF waren für die Probenentnahme und histologische Beurteilung der Proben verantwortlich. SG war für die Bildklassifizierung und die 3D-Rekonstruktionsabläufe verantwortlich. YJ und KB waren für die räumliche Zellanalyse und die Entwicklung der interaktiven Diagramme verantwortlich. SC führte eine statistische Analyse der Daten durch. FG und KB haben den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. Alle Autoren beteiligten sich an der Datenanalyse, Manuskripterstellung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Katy Börner oder Fiona Ginty.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: LDF ist Gründer und hält Kapitalbeteiligungen an SkinJect und Panther Life Sciences. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Jia-Ren Lin und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Christina Karlsson Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ghose, S., Ju, Y., McDonough, E. et al. 3D-Rekonstruktion der Haut und räumliche Kartierung der Immunzelldichte, der Gefäßentfernung und der Auswirkungen von Sonneneinstrahlung und Alterung. Commun Biol 6, 718 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04991-z

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Eingegangen: 28. April 2022

Angenommen: 11. Mai 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04991-z

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