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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4690 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Lateral-Flow-Antigentests wurden in der Covid-19-Pandemie häufig eingesetzt, um schnellere diagnostische Testergebnisse zu ermöglichen und eine weitere Virusausbreitung durch Isolierung infizierter Personen zu verhindern. Dieses Screening muss mit Tests durchgeführt werden, die eine zufriedenstellende Empfindlichkeit aufweisen, um das Zielprotein erfolgreich nachzuweisen und falsch negative Ergebnisse zu vermeiden. Das Ziel dieser Studie bestand darin, einen Lateral-Flow-Test zu entwickeln, der SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein in niedrigen Konzentrationen nachweisen kann, die mit den Nachweisgrenzen vergleichbar sind, die von bestehenden Tests auf dem Markt gefordert werden. Dazu waren bei der Forschung und Entwicklung der Prototypen mehrere Anpassungen notwendig, bis sie diesen Kriterien entsprachen. Die vorgeschlagenen Alternativen zur Erhöhung der Antikörperkonzentration der Testlinie und zum Hinzufügen einer Intermembran zwischen dem Konjugatpad und der Nitrozellulosemembran konnten die Empfindlichkeit um das Vierfache steigern und einen neuen Schnelltest-Prototyp namens „Lateral Flow Intermembrane Immunoassay Test“ (LFIIT) hervorbringen. . Dieser Prototyp zeigte eine ausreichende Nachweisgrenze (2,0 ng mL−1) und blieb gleichzeitig erschwinglich und einfach in den Herstellungsprozessen.

Im Dezember 2019 wurden in der Stadt Wuhan in der chinesischen Provinz Hubei mehrere Patienten mit Lungenentzündungssymptomen unbekannter Ursache ins Krankenhaus eingeliefert. Nachfolgende Studien lieferten überzeugende Beweise dafür, dass der Huanan-Markt für Meeresfrüchte und Wildtiere in Wuhan mit dem Ausbruch in Zusammenhang stehen könnte. Der Erreger wurde als Betacoronavirus der Untergattung Sarbecovirus der Unterfamilie Orthocoronavirinae identifiziert und zunächst als 2019-nCoV bezeichnet, das später in SARS-CoV-21 umbenannt wurde.

Coronaviren sind umhüllte einzelsträngige Positiv-Sense-RNA-Viren, die hauptsächlich die Atemwege befallen, aber auch neurologische, enterische und hepatische Auswirkungen haben können2,3. Bis Dezember 2019 war bekannt, dass sechs Coronaviren Menschen infizieren, von denen vier leichte grippeähnliche Symptome verursachten, während die anderen beiden für hochpathogene Epidemien verantwortlich waren: SARS-CoV und MERS-CoV4,5,6. Ebenso erklärte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) im März 2020 die neuartige Coronavirus-Krankheit (COVID-19) zu einer globalen Pandemie, die durch SARS-CoV-27,8 verursacht wird.

SARS-CoV-2 hat eine genetische Ähnlichkeit von 79,5 % mit SARS-CoV und der Zusammenbau viraler Partikel hängt von vier Hauptstrukturproteinen ab: Membranproteinen (M), Nukleokapsidproteinen (N), Hüllproteinen (E) und Spikeproteinen (S). nichtstrukturelle und akzessorische Proteine9,10. Die Hauptinfektionsmethode von SARS-CoV-2 beruht auf dem Spike-Glykoprotein, das eine trimere Struktur auf der Oberfläche des Virus aufweist. Es besteht aus zwei Untereinheiten: S1 und S2, wobei S1 eine Rezeptorbindungsdomäne (RBD) besitzt und für die Bindung mit dem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2), dem Hauptrezeptor für SARS-CoV-2 in Wirtszellen, verantwortlich ist11. Aus diesem Grund wurde das Spike-Protein mit großer Aufmerksamkeit für die Forschung und Entwicklung von therapeutischen Medikamenten und Impfstoffen gegen COVID-1912 ins Visier genommen. Allerdings ist das Spike-Protein auch das Strukturprotein, das am stärksten von genetischen Mutationen bei verschiedenen Varianten von SARS-CoV-2 betroffen ist, was zu wichtigen Veränderungen bei der Antikörpererkennung führt und sich auf diagnostische Tests und Impfstoffe auswirkt13. Ähnliche Studien zeigten, dass das N-Protein zwischen den Varianten viel stärker konserviert ist und dass seine Mutationen bisher keinen Einfluss auf die Antikörperbindung in Schnelltests haben, was es zu einem besseren Ziel für SARS-CoV-2-Antigen-Schnelltests macht14.

Schnelltests bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Labormethoden, die geschultes Personal und Ausrüstung erfordern und mehr Zeit in Anspruch nehmen, um Ergebnisse zu erhalten15. Darüber hinaus korrelieren Antigentests tendenziell gut mit dem Ansteckungsstatus des Patienten und erweisen sich im Vergleich zu molekularen Methoden als wirksames Instrument zur Isolierung der Infizierten und zur Reduzierung der Virusausbreitung16.

In diesem Szenario handelt es sich bei Hilab um ein entferntes klinisches Labor, das mithilfe tragbarer proprietärer Geräte, die vom multidisziplinären Forscherteam des Unternehmens entwickelt wurden, mehrere klinische Tests an verschiedenen menschlichen Proben durchführen kann. Der Hilab-Dienst nutzt Technologien des Internets der Dinge (IoT) und der künstlichen Intelligenz (KI), um doppelt verifizierte Ergebnisse bereitzustellen, die aus den Proben über die Geräte gesammelt und von Deep-Learning-Netzwerken analysiert werden, die einen ersten Einblick in den Gesundheitszustand eines Patienten bieten. Diese Daten werden dann von medizinischen Fachkräften überprüft, die die Berichte innerhalb von Minuten validieren, unterzeichnen und an die E-Mails und Mobiltelefone des Patienten zurücksenden. Hilab Flow (Abb. 1) ist eines der Hauptgeräte des Unternehmens, ein kleiner Handanalysator (12,4 × 12,4 × 12,7 cm; 0,45 kg), der in einem Szenario mit mehreren Methoden arbeitet und Immunchromatographie, Immunfluoreszenz, Kolorimetrie und Trockenchemie durchführen kann Point-of-Care-Tests mit der Servicetechnologie des Unternehmens als Hintergrund. Gasparin et al. Kürzlich wurde eine Arbeit veröffentlicht, in der die Verwendung von Hilab Flow für die Hämoglobinmessung mittels trockenchemischer Vertikalflusskolorimetrie in Vollblut als Teil eines von Hilab-Forschern entwickelten vollständigen Blutbildtests beschrieben wird, obwohl die meisten in Hilab Flow durchgeführten Tests auf Lateral-Flow-Immunoassays basieren ( LFIAs)17.

Hilab Flow, ein Gerät, das Lateral-Flow- und Vertical-Flow-Point-of-Care-Tests durchführen kann.

Das Gerät ist patentiert und bei der brasilianischen Gesundheitsbehörde (ANVISA – Registrierungsnummer 80583710007) registriert und mit CMOS-Sensoren und multispektralen Lichtquellen ausgestattet, die in der Lage sind, die Kapsel mit dem Streifen im Inneren des Geräts zu beleuchten. Nach der Lichtemission und dem Signalempfang werden die Daten erfasst und durch eine proprietäre Software verarbeitet, die Bildverarbeitung, Deep Learning, neuronale Netze und andere KI-Techniken einsetzt, um Signal-Rausch-Verhältnisse durch Messung der spitzenbildenden optischen Dichte der Bänder zu berechnen .

LFIA ist für ihre gute Leistung bei Point-of-Care-Tests bekannt, die den Bedarf an hochqualifizierten Fachkräften oder Laborinfrastruktur überflüssig macht und mit ihren niedrigen Kosten für Erschwinglichkeit sorgt18. Diese Eigenschaften machen LFIAs besonders wirksam, wenn es darum geht, Bevölkerungsgruppen mit geringen Ressourcen und/oder mangelnder Struktur sowie Testszenarien mit hohem Bedarf wie Gesundheitsnotfällen oder Pandemien zu erreichen19. LFIAs vom Typ „Sandwich“ sind papierbasierte Diagnosegeräte, die nach immunchromatographischen Prinzipien zum Nachweis klinisch relevanter Analyten in einer Vielzahl von Proben arbeiten. Nach der Abgabe der Probe mit einem Laufpuffer auf dem Probenpad interagiert der Analyt, sofern vorhanden, mit Getrocknete Reagenzien wie Nanopartikel, die mit Antikörpern konjugiert sind und durch Kapillarwirkung wandern, bis die Immunkomplexe die Testlinie erreichen, bestehend aus einem zweiten Antikörper für denselben Analyten, der die Reagenzien bindet und ein reaktives Signal zeigt. Der Teststreifen enthält auch einen zweiten Linie mit spezifischen Antikörpern für ein Kontrollkonjugat, um zu zeigen, dass der Streifen ordnungsgemäß funktioniert und als interne Kontrolle fungiert20.

Um ein gutes Management der Virusausbreitung bei COVID-19 zu gewährleisten, müssen Schnelltests, die zum Screening verwendet werden, eine gute Empfindlichkeit für den Nachweis des SARS-CoV-2-N-Proteins aufweisen, falsch negative Ergebnisse vermeiden und korrekte Informationen über den Infektionsstatus liefern. Vor diesem Hintergrund ist das Konzept der Nachweisgrenze als niedrigste Analytkonzentration, die sicher vom Leerwert unterschieden werden kann, ein wichtiges Instrument zur Bewertung der Empfindlichkeit in diagnostischen Tests21, und diese Informationen können zur Ermittlung der Notwendigkeit einer Empfindlichkeit führen Verstärkungsstrategien bei der Entwicklung dieser Lösungen. Die klinische Empfindlichkeitsleistung mehrerer in Brasilien kommerziell erhältlicher SARS-CoV-2-N-Antigen-Diagnosetests wurde in einem kürzlich von Freire et al. veröffentlichten Artikel verglichen, in dem die Autoren die Empfindlichkeitsschwankung in einem Bereich von 9,8 bis 81,1 % beschrieben. Geringe Empfindlichkeiten dieser Screening-Tests könnten die Wirksamkeit von Massentests bei der Kontrolle der SARS-CoV-2-Virusausbreitung beeinträchtigen, indem sie es infizierten Personen ermöglichen, in engem Kontakt mit gesunden Gegenstücken zu bleiben22.

In dieser Arbeit haben wir vergleichende Informationen über Strategien zur Empfindlichkeitssteigerung beschrieben, die bei der Entwicklung eines Goldnanopartikel-LFIA zum Nachweis des SARS-CoV-2-Antigens (N-Protein) angewendet wurden. Erstens konnte durch eine Erhöhung der Antikörperkonzentration in der Testlinie die Empfindlichkeit des Prototyps verdoppelt werden. Um die Empfindlichkeit weiter zu erhöhen und vergleichbare Nachweisgrenzen zu Benchmarking-Tests des Marktes zu erreichen oder zu übertreffen, war eine zweite Strategie erforderlich. In diesem Zusammenhang wurden zwei Wege evaluiert: Erhöhung der Konzentration des kolloidalen Goldkonjugats und Einfügung einer Baumwoll-Intermembran, um die Interaktionszeit zwischen Antikörper und Antigen zu verlängern.

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Testprototypen wurden vom Forschungs- und Entwicklungsteam für Laborinnovation (Immunchromatographie) bei Hilab, Brasilien, entwickelt und getestet und in Hilab Flow (ANVISA-Registrierungsnr. 80583710007) sowie mit bloßem Auge auf beste Korrelation und bewertet Anwendbarkeit.

Kolloidale Goldnanopartikel (40 nm) wurden von Arista Biologicals gekauft und als Nachweismarkierung für Test- und Kontrollantikörper verwendet. Die Konjugate wurden mit einem Nanodrop UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific) auf Absorption analysiert. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die zur Verdünnung der Antikörper und zur Herstellung von Puffern verwendet wurde, wurde von Sigma Aldrich (CAT P7059) bezogen. Fängerantikörper für Test- und Kontrolllinien wurden von Arista Biologicals erworben (COVID-19-Nukleoprotein-mAb bzw. Ziegen-Anti-Maus-IgG). Für die Laminierung der LFIIT-Platten wurde Standard 14-Glasfaser von Cytiva (22 mm × 50 m) sowohl als Proben- als auch als Konjugatpads (355 µm Dicke bei 53 kPA) verwendet. Für die Intermembranstrategie wurden Whatman MF1-gebundener Glasfaserfilter und CF3-Baumwoll-Lintermaterial (322 µm Dicke bei 53 kPA) von Cytiva (22 mm × 50 m) erworben. Die Nitrozellulosemembran CN140 wurde von Sartorius bezogen (25 mm × 100 m, Dicke 225–255 µm, Kapillargeschwindigkeit 95–155 s/40 mm). CF5-Baumwoll-Lintermaterial (954 µm Dicke bei 53 kPA) wurde als Dochtpolster verwendet und von Cytiva gekauft (27 mm × 50 m). Der Nachweistest wurde mit dem rekombinanten N-Protein FPZ0513 von Fapon SARS-CoV-2 durchgeführt, das in E. coli exprimiert wurde. Der Vergleich der Testlinienintensität wurde mit der Zeptometrix SARS-CoV-2-Antigenkontrolle 0810590CFHI durchgeführt. Die Abgabe von Test-/Kontrolllinien und CGC erfolgte mit einem Lateral-Flow-Reagenzienspender von JH.Bio (Modell: XYZ3020). Das Trocknen aller Materialien wurde mit einem Umluftofen-Inkubator von Solidsteel (Modell SSB.O.DU-342L) durchgeführt. Das Schneiden der Blätter in Lateral-Flow-Teststreifen erfolgte mit einem automatischen Guillotinenschneider (Xangai Jiening Biotec, Modell CM3030). Um das CGC bis zu 30 OD zu zentrifugieren, wurde eine von Novatécnica erworbene Mikrozentrifuge Modell NT805 verwendet.

Kolloidale Goldnanopartikel (40 nm) wurden passiv an kommerziell erhältliche SARS-CoV-2-Anti-Nukleokapsid-Antikörper (Arista Biologicals, Allentown, PA) konjugiert. Die Stammkonzentration des kolloidalen Goldkonjugats (CGC) betrug 20 OD mit einem chargenabhängigen pH-Wert von 8,5–9,2. Gegebenenfalls wurde das kolloidale Gold in einer Mikrozentrifuge (8000 × g, 8 °C für 20 Minuten) auf 30 OD konzentriert. Um das CGC zu konzentrieren, wurde nach der Zentrifugation das proportionale Volumen des Überstands verworfen, ohne das Pellet zu resuspendieren. Nach dem Pipettieren wurde das Pellet in einem Ultraschallbad resuspendiert und die neue OD mit einem Nanodrop One UV-Vis-Spektrophotometer bei 530 nm bestätigt. Eine Mischung aus 80 % Anti-N-CGC und 20 % Kontroll-CGC (Maus-IgG) wurde auf die Konjugatpads gesprüht (10 μl cm–1), um sie auf den Teststreifen anzubringen.

Der LFIIT weist im Vergleich zu einem herkömmlichen lateralen Fluss Modifikationen für die Intermembraninsertion auf. Auf diese Weise basierte das Modelllayout auf einem Probenpad, einem Konjugatpad, einer Intermembran, einer Nitrozellulosemembran und einem absorbierenden Pad. Zur Vorbereitung des Probenpads wurde eine Vorbehandlung mit einer Natriumtetraboratlösung (50 mM, pH 7,5, 1 % BSA) durchgeführt und etwa zwei Stunden lang in die Pufferlösung eingetaucht (~ 25 °C, ~ 50 % relative Luftfeuchtigkeit). . Um das Probenpad zu trocknen, wurde das Material 2 Stunden lang in einen Inkubator mit Umlufttrocknungsofen (~ 20 % relative Luftfeuchtigkeit, 37 °C) gelegt. Das Konjugatkissen wurde mit der CGC-Mischung in einer Konzentration von 20 OD mit Saccharose (5,0 %) und Trehalose (5,0 %) mit einem Lateral-Flow-Reagenzspender besprüht. Nach der Imprägnierung wurden die CGCs auch zwei Stunden lang in einem Umluft-Trockenofen-Inkubator (~ 20 % relative Luftfeuchtigkeit, 37 °C) getrocknet. Fängerantikörper wurden als Test- und Kontrolllinien in der Nitrozellulosemembran unter Verwendung desselben Lateral-Flow-Reagenzienspenders verteilt. Die Antikörper wurden in einer 0,01 M PBS-Lösung (pH 7,4) auf die gewünschte Konzentration verdünnt und die imprägnierten Blätter wurden zwei Stunden lang in einem Umlufttrocknungsofen-Inkubator (~ 20 % RH, 37 °C) getrocknet. Nach dem Trocknen der Komponenten wurden das Probenkissen (1,5 cm × 0,4 cm), das Konjugatkissen (1,0 cm × 0,4 cm), die Intermembran (0,7 cm × 0,4 cm), die Nitrozellulose (2,5 cm × 0,4 cm) und das absorbierende Kissen (1,5 cm × 0,4 cm) entfernt 0,4 cm) wurden nacheinander auf Standard-Klebeträgerkarten mit einer Dicke von 0,2 mm laminiert und die Blätter wurden mit einem automatischen Guillotine-Schneider in 4,0 mm Querflussstreifen geschnitten.

Um das Testverfahren zu simulieren und die entsprechenden analytischen Reaktionen zu erhalten, wurden die unten beschriebenen kommerziellen Kontroll-/Kalibratorproben in dem in einer Tropfflasche bereitgestellten Extraktionspuffer auf die beschriebenen Konzentrationen oder Anteile verdünnt. Um den Test zu starten, werden vier Tropfen der Extraktionslösung (~ 80 μl) direkt in den angegebenen Bereich des Probenpads gegeben. Die Ergebnisse wurden nach 15 Minuten mit einer visuellen Interpretation (mit bloßem Auge) als „reaktiv“ mit einer sichtbaren Testlinie und „nicht reaktiv“ ohne erkennbare Testlinie abgelesen, und eine Hilab-Flow-Analyse ergab „positiv“ oder „negativ“.

Um die Sensitivitäts- und Nachweisgrenze (LOD)-Experimente durchzuführen, wurde ein gereinigtes SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (FPZ0513, Fapon, Taiwan, CN) verwendet. Das Protein wurde in 80 μl des Prototyp-Laufpuffers in vordefinierten Konzentrationen verdünnt: 10 ng mL-1, 5 ng mL-1, 3,75 ng mL-1, 2 ng mL-1 und 1 ng mL-1, entsprechend ein Protein-Inokulum von 0,8 ng, 0,4 ng, 0,28 ng, 0,16 ng bzw. 0,08 ng pro Test. Die Tests wurden zunächst mit fünf Replikaten durchgeführt. Zum besseren Verständnis der Cutoffs und Grenzwerte wurden die Replikate bei kritischen Schwellenkonzentrationen (nahe dem Cutoff) auf 20 erhöht. Die als Nachweisgrenze des Tests definierte Konzentration wurde berücksichtigt, wenn 95 % der Replikate (19/20) reaktive Testlinien aufwiesen, unabhängig von der erhaltenen Intensität23. Bezüglich des kommerziellen Antigenkontrollmaterials wurde Zeptometrix SARS-Related Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Isolate: Hong Kong/VM20001061/2020 Culture Fluid (Hitzeinaktiviert) (Katalognummer 0810590CFHI) verwendet und die entsprechenden proportionalen Verdünnungen wurden in der hergestellt Assay-Extraktionspuffer.

Diese Studie wurde nur mit dem Schnelltest-Prototyp durchgeführt und es wurden keinerlei menschliche Proben zu seiner Optimierung verwendet. Es wurden nur ein kommerziell gereinigtes rekombinantes SARS-CoV-2 N-Protein und ein Kontrollmaterial aus inaktivierten Viruspartikeln aus Kulturflüssigkeit verwendet, daher ist keine Genehmigung der Ethikkommission oder Zustimmung des Patienten anwendbar.

Statistische Daten wurden mit der Graphpad Prism-Software (Version 7, San Diego, CA, USA) analysiert und grafisch dargestellt. Es wurde ein einseitiger ANOVA-Test durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener Strategien zur Empfindlichkeitssteigerung auf die Intensität der Testlinien zu vergleichen, die durch Messung der optischen Dichte mit dem Hilab Flow-Gerät erfasst wurden. Gegebenenfalls wurde ein Post-hoc-Tukey-Test durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt.

Der ursprüngliche Prototyp des in dieser Arbeit beschriebenen Tests wurde nach einer schrittweisen Optimierung einzelner Komponenten entwickelt, wobei die besten Kandidaten in jedem Experiment zur nächsten Entwicklungsstufe übergingen, bis der vollständige Messstabstreifen und der Laufpuffer definiert waren eine Konjugatkonzentration von 20 OD, gesprüht mit einer Abgaberate von 10 μL cm−1 und eine Testlinie mit 1,5 mg mL−1 Antikörperstreifen. Nach der Entwicklung aller Komponenten des Testkits ist es notwendig, die vorläufige Empfindlichkeit des Prototyps zu bewerten, um seine Kompatibilität mit dem vorgesehenen Verwendungszweck und der Konzentration des nachzuweisenden Analyten zu überprüfen. Aus dieser Überprüfung ergeben sich in der Regel weitere Optimierungsbedarfe für die Testkomponenten, bis die Anforderungen erfüllt sind24. Nachfolgend werden die von der Gruppe umgesetzten Strategien zur Bewältigung dieses Problems der analytischen Sensitivität beschrieben.

Der erste Prototyp wurde mit einem LoD-Test getestet, der in der FDA-Vorlage für die Entwicklung von SARS-CoV-2-Antigentests empfohlen wird und der den LoD als die niedrigste Proteinkonzentration festlegt, die von 19 von 20 Testreplikaten im Experiment nachgewiesen wurde23. Das Screening der anfänglichen LoD in diesem nicht optimierten Prototyp ergab 7,5 ng mL-1 N-Protein, was im Hinblick auf die Empfindlichkeit im Vergleich zu Daten aus der Literatur und ähnlichen Schnelltests auf dem Markt zu kurz war25,26.

Nach diesen Experimenten wurde eine Anpassung der Antikörperkonzentration der Testlinie vorgenommen und die Menge auf 3,0 mg mL-1 verdoppelt, was im Hinblick auf die Kosten eine akzeptable Imprägnierungsrate darstellte (der Anstieg lag im Vergleich zu lokalen Preisen immer noch innerhalb der Zielpreise für das zukünftige Produkt). Konkurrenten) und effektive Antikörperbindung an Nitrozellulose ohne Verdrängung während der Streifenmanipulation und Testdurchführung, da höhere Konzentrationen tendenziell die Stärke der Wechselwirkungen zwischen Protein und Nitrozellulose negativ beeinflussen und möglicherweise zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten27. Das anfängliche Screening für die LoD wurde mit dem Protokoll von Fünffachtests für vier Anfangskonzentrationen von N-Protein durchgeführt: 100,0, 10,0, 5,0 und 1,0 ng mL-1, mit visueller und apparativer Interpretation der Ergebnisse, wie in Tabelle 1 gezeigt.

Die Ergebnisse zeigten, dass die LoD des Prototyps zwischen Konzentrationen von 5,0 und 1,0 ng mL−1 N-Protein lag. Da die Konzentration des Antikörpers der Testlinie verdoppelt wurde, wurde angenommen, dass die mittlere Nachweisgrenze bei der Hälfte der ursprünglich festgelegten Grenze liegt (7,5 ng mL−1).

Um die tatsächliche Nachweisgrenze zwischen 5,0 und 1,0 ng mL-1 zu überprüfen, wurde daher ein Experiment mit 20 Replikaten unter Verwendung einer N-Protein-Konzentration von 3,75 ng mL-1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 aufgeführt, und ein repräsentatives Bild der für die Durchführung dieser Studien verwendeten Streifen ist in Abb. 2 dargestellt.

P1 + 3,0 Grenze der Nachweisergebnisse für 3,75 ng mL−1 SARS-CoV-2 N-Protein. Replikate 1, 12 und 19: schwache Linien als reaktive Signale werden durch die Pfeile angezeigt. Replikat 8: keine erkennbare Testlinie (nicht reaktiv). Die Kontrolllinie zeigt die ordnungsgemäße Funktion der Teststreifen.

Daher führte die Strategie zur Erhöhung der Fängerantikörperkonzentration zu einer proportionalen Steigerung der Empfindlichkeit, wodurch eine gute Wettbewerbsfähigkeit des Prototyps gegenüber anderen kommerziell erhältlichen Tests mit dem 3,75 ng mL−1 LoD22,25,26 erreicht wurde. Dieser Prototyp wurde in die nächste Entwicklungs- und Optimierungsstufe überführt.

Nachdem die erste Sensitivitätssteigerung erreicht wurde, um mit Wettbewerbstests auf dem Markt mithalten zu können, war eine zweite Sensitivitätsoptimierung noch möglich und sinnvoll, um eine zuverlässige Diagnose früher und niedriger Viruslastinfektionen zu gewährleisten. Eine Erhöhung der Konjugat-OD könnte dieses Problem lösen, indem die Menge an goldmarkiertem Antikörper pro Streifen erhöht wird. Diese Strategie bringt jedoch einen erheblichen Anstieg der Reagenzkosten mit sich, wenn man bedenkt, dass CGC eine der teuersten Komponenten in einem Lateral-Flow-Test28 ist. Untersuchungen zur aktuellen Literatur ergaben erschwingliche und wirksame Strategien zur Empfindlichkeitssteigerung bei LFIAs, indem sie eine längere Reaktionszeit zwischen dem Analyten und dem CGC durch die Einfügung benetzbarer/poröser Materialien zwischen dem Konjugatkissen und der Nitrozellulosemembran ermöglichen, wie z. B. Schwämme29, Polyester, Zellulose usw Glasfasern30, während andere ein ähnliches Konzept anwenden, indem sie eine Wachsbarriere verwenden, um die Antigen-Antikörper-Interaktionszeit zu verlängern31. Durch das Einbringen einer zusätzlichen Materialschicht kann der Flüssigkeitsfluss durch den Streifen zurückgehalten oder verlangsamt werden, wodurch ein Inkubationsschritt im laufenden Betrieb simuliert wird, da Antikörper und Antigene länger in engem Kontakt bleiben. Diese geometrischen und Papierarchitekturmodifikationen ermöglichen die Manipulation der LFIA-Attribute und haben einen wichtigen Einfluss auf die Testempfindlichkeit und die Gesamtleistung32.

Vor diesem Hintergrund wurden neue Streifenprototypen erstellt, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, entweder durch Konzentration des CGC auf 30 OD oder durch Neuorganisation der Anordnung der LFIAs, um eine Zwischenmembran (7 mm Länge) zwischen dem Konjugatkissen und Nitrozellulose einzubauen (Abb. 3B), im Gegensatz zu einer herkömmlichen Lateral-Flow-Streifenanordnung (Abb. 3A).

Traditionelles LFIA und ein neues vorgeschlagenes Design namens LFIIT. (A) Seitenansicht eines herkömmlichen Lateral-Flow-Streifens mit Darstellung der Testkomponenten und der Montagereihenfolge. (B) Seitenansicht eines LFIIT-Prototyps (Einfügung einer Zwischenmembran) mit Darstellung der Testkomponenten und der Montagereihenfolge. Bilder nicht im Maßstab und in den Proportionen.

Um die Wirkung verschiedener Materialien in der Intermembranzusammensetzung zu bewerten, wurden eine Glasfaser (MF1, Whatman) und eine Baumwollfaser (CF3, Whatman) getestet. Die neuen Prototypen mit den Bezeichnungen P2 (Original P1 + 3.0), P2 + 30 OD (Original mit 30 OD CGC), P2 + MF1 (Original mit MF1-Zwischenmembran) und P2 + CF3 (Original mit CF3-Zwischenmembran) wurden zunächst mit getestet eine im Handel erhältliche Antigenkontrolle, die auf einer inaktivierten Kulturflüssigkeit von SARS-CoV-2 (Zeptometrix, NY, EUA) basiert, mit Reihenverdünnungen zur Messung der anfänglichen Leistung der Prototypen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Ergebnisse mit der Antigenkontrolle zeigten, dass die Prototypen P2 + 30 OD und P2 + CF3 im Vergleich zum P2-Prototyp eine ähnliche Empfindlichkeitssteigerung aufwiesen. Repräsentative Bilder des Experiments sind in Abb. 4A zu sehen. Ein Vergleich der relativen Intensitäten der von Hilab Flow erfassten Testlinien anhand der optischen Dichte der Linien (Ergänzungstabelle S1) ergab, dass sowohl die P2 + 30 OD- als auch die P2 + CF3-Signale signifikant höher waren als die anderen Prototypen und sich auch nicht signifikant von diesen unterschieden zueinander (Abb. 4B,C). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Einfügung der Baumwoll-Intermembran möglicherweise das Signal in der gleichen Größenordnung der CGC-Konzentration auf 30 OD erhöhen konnte, was bedeutet, dass die vom Material bereitgestellte längere Reaktionszeit zwischen Antikörpern und Antigen zu derselben analytischen Empfindlichkeit führen könnte oder LoD einer CGC-Erhöhung von 50 % mit einer einfacheren und vernünftigeren Lösung.

LFIA-Prototypen signalvergleichen eine kommerziell erhältliche SARS-CoV-2-Antigenkontrolle. (A) Repräsentatives Bild der Tests. P2: Original P1 + 3,0 (3,0 mg mL−1 Antikörperkonzentration auf der Testlinie); P2 + 30 OD: Original mit 30 OD CGC; P2 + MF1: Original mit MF1-Intermembran; P2 + CF3: Original mit CF3-Zwischenmembran; Die Kontrolllinie zeigt die ordnungsgemäße Funktion der Teststreifen. (B) Balkendiagramm, das den statistischen Vergleich zwischen den Intensitäten der Testlinien auf verschiedenen Prototypen unter Verwendung einer im Handel erhältlichen SARS-CoV-2-Antigenkontrolle zeigt. (C) Signalvergleich für 1:16-Verdünnung des gleichen Kontrollmaterials. Signal: Relative Intensitätseinheiten, gemessen von Hilab Flow. # stellt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur P2-Gruppe dar. *Stellt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur P2 + MF1-Gruppe dar. Der Vergleich zwischen P2 + 30OD und P2 + CF3 zeigte keinen signifikanten statistischen Unterschied. Bei Bedarf für p < 0,05 wurden eine einfaktorielle ANOVA und ein Tukey-Post-hoc-Test durchgeführt.

Trotz der oben gezeigten vielversprechenden Ergebnisse unter Verwendung der kommerziellen Kontrolle war zusätzlich zum Vergleich zwischen den Kandidaten für eine genauere Entscheidungsfindung über die Entwicklung noch ein Experiment mit dem SARS-CoV-2-N-Protein erforderlich, um die Verbesserung der LoD der Prototypen zu bestätigen der Test.

Um die erhöhte Empfindlichkeit der neuen Kombinationen zu überprüfen, wurden sowohl P2 + 30 OD- als auch P2 + CF3-Prototypen getestet, da sie im vorherigen Experiment das beste Potenzial aufwiesen. Das SARS-CoV-2 N-Protein wurde auf eine Konzentration von 2,0 ng mL-1 verdünnt, was nach Berechnung der Verdünnung in Lauf-/Extraktionspuffer eine Rohmenge von 0,16 ng Protein pro Test ergab, was der Hälfte der für den letzten LoD festgelegten Konzentration entspricht Experiment. Die Ergebnisse dieses LoD-Screenings sind in Tabelle 4 dargestellt und ein visueller Vergleich ist in Abb. 5 zu sehen.

Vergleich der Prototypen P2 + CF3 und P2 + 30 OD in Bezug auf die Nachweisgrenze bei Verwendung einer Proteinverdünnung von 2,0 ng mL−1. P2 + CF3: Originalprototyp mit einem CF3-Intermembranzusatz. P2 + 30 OD: Original mit 30 OD CGC. Schwache Linien als reaktive Signale sind durch die Pfeile angedeutet. Die Kontrolllinie zeigt die ordnungsgemäße Funktion der Teststreifen.

Wie in Abb. 5 zu sehen ist, war die Intensität des Signals auf der Testlinie für eine N-Protein-Konzentration von 2,0 ng mL−1 relativ niedrig, was darauf hindeutet, dass die LoD der Prototypen in der Nähe dieser Konzentration lag. Da dieses Experiment für beide Prototypen ähnliche Ergebnisse zeigte, wurde der günstigste Kandidat für den vollständigen LoD-Test (P2 + CF3 oder LFIIT) ausgewählt, indem die Anzahl der Replikate auf zwanzig erhöht wurde.

Für dieses Experiment wurde wie üblich das empfohlene Standardtestprotokoll zur Nachweisgrenze befolgt. N-Protein wurde in der gleichen Konzentration verdünnt, die im LOD P2 + 30 OD- und P2 + CF3-Vergleich getestet wurde (2,0 ng mL−1). Die erwartete Nachweisgrenze sollte für mindestens 19 reaktive Ergebnisse in 20 getesteten Replikaten definiert werden (95 % Nachweisrate). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Die Ergebnisse zeigten, dass das LFIIT in 19 der 20 getesteten Replikate ein reaktives Signal lieferte, was die Nachweisgrenze des Tests mit 2,0 ng mL-1 N-Protein oder 0,16 ng Gesamtprotein-Inokulum pro Test definierte und somit die erhöhte Empfindlichkeit bestätigte durch die Verwendung der Intermembran und der Ausschluss der Notwendigkeit einer erhöhten Menge an kolloidalem Gold. Ein repräsentatives Bild der Ergebnisse ist in Abb. 6 zu sehen.

Endgültige Nachweisgrenze für den LFIIT-Prototyp mit 2,0 ng mL−1 SARS-CoV-2 N-Protein. LFIIT-Lateral-Flow-Intermembran-Immunoassay-Test (P2 + CF3). Schwache Linien als reaktive Signale sind durch die Pfeile angedeutet. Die Kontrolllinie zeigt die ordnungsgemäße Funktion der Teststreifen.

SARS-CoV-2-Antigentests stellen ein wichtiges Instrument für das Management und die Kontrolle von Pandemien dar. Sie werden häufig für Massenscreenings eingesetzt und bieten mehrere Vorteile gegenüber laborzentrierten Methoden, insbesondere wenn die Durchlaufzeit entscheidend ist und sofortige Ergebnisse erforderlich sind, obwohl sie weniger empfindlich als molekulare Tests sind Testen im Allgemeinen33. Dies führt zu einer Verschiebung des Kosten-Nutzen-Verhältnisses zugunsten des Einsatzes von LFIAs bei Covid-19, wobei Schätzungen auf einen deutlichen Rückgang der Zahl der Fälle, Krankenhausaufenthalte, Einweisungen auf Intensivstationen und Todesfälle hindeuten34. Um diese Aufgabe zu erfüllen, müssen die Tests jedoch eine ausreichende Empfindlichkeit und niedrige Kosten aufweisen. Diese Parameter ermöglichen Massen-Antigen-Screening-Strategien, die auch bei asymptomatischen Personen umgesetzt werden können und Überwachungstests zur Prävention und Kontrolle wiederkehrender Ausbrüche darstellen35.

Überraschenderweise führte in unserer Arbeit die kostengünstige und einigermaßen einfache Strategie der Intermembranaddition zu ähnlichen Ergebnissen wie die Konzentrationserhöhung des Konjugats, was zu einem zweiten zweifachen Empfindlichkeitsgewinn des Tests führte. Insgesamt wurde für den Prototyp des Lateral-Flow-Intermembran-Immunoassay-Tests (LFIIT) eine vierfache Empfindlichkeitssteigerung bei gleichzeitiger Erschwinglichkeit und einfachen Herstellungsbedingungen erzielt, was ihn zu einer wettbewerbsfähigen und praktikablen Lösung für SARS-CoV-2-Antigentests macht.

Eine vorläufige Kostenanalyse der Strategien ergab, dass die Konjugatkonzentration individuelle Kosten von etwa 7,20 US-Dollar pro ungeschnittenem Blatt verursachen würde, während die Verwendung von CF3 als Intermembran in der gleichen Anzahl von Tests 4,61 US-Dollar kosten würde, was einer Kostenreduzierung von 35 % entspricht gleiche Empfindlichkeitssteigerung und Testleistung. Darüber hinaus ist das Einfügen von Intermembranen ein viel einfacherer Herstellungsprozess, was eine gleichzeitige Kostenreduzierung bei Personal, Ausrüstung und Infrastruktur mit sich bringt, da die CGC-Konzentration ein kritischer und zeitaufwändiger Prozess ist.

Ein dritter Prototyp, der die Empfindlichkeit potenziell noch weiter erhöhen könnte, wurde ebenfalls getestet (P2 + CF3 + 30OD), aber die Nachweisgrenze war dieselbe wie beim LFIIT-Prototyp (Daten nicht gezeigt), möglicherweise aufgrund der Antikörpersättigung der Testlinie.

Obwohl LFIAs einfach anzuwenden, skalierbar und kostengünstig sind, weisen sie aufgrund der dynamischen Natur der Reaktionen und der Kinetik der Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen tendenziell eine geringere Empfindlichkeit auf als herkömmliche Immunoassays wie ELISA. Die Notwendigkeit, Tests für die Öffentlichkeit im Allgemeinen zu erleichtern, führt dazu, dass LFIAs in der Regel über Verfahren mit wenigen und einfachen Arbeitsschritten verfügen, ohne Inkubations- oder Waschschritte, und dies könnte möglicherweise zu Einschränkungen bei Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen führen36.

Die Festlegung einer möglichst niedrigen Nachweisgrenze ist auch bei der Entwicklung eines SARS-CoV-2-Antigentests äußerst wichtig, da die Isolierung der Patienten stark von der Positivität des Antigentests abhängt und eine Übertragbarkeit viel wahrscheinlicher ist. Antigentests mit optimierten Nachweisgrenzen sind tendenziell auch zuverlässiger, wenn es darum geht, sicherzustellen, dass die Viruslast unter einer Infektiositätsschwelle liegt, wenn die Entscheidung über die Beendigung der Isolationsphase getroffen wird37. Eine vergleichende Analyse zwischen dem in dieser Arbeit entwickelten LFIIT und anderen SARS-CoV-2-Antigentests ist unten in Tabelle 6 dargestellt.

Mit diesen Ergebnissen ist es möglich, Einblicke in kostenbewusste Strategien zur Sensitivitätssteigerung zu gewinnen, die die Grenzen der Erkennungsherausforderungen kompensieren können, die bei der Entwicklung von Point-of-Care-LFIA-Diagnoselösungen auftreten. Durch die Erhöhung der Antikörperkonzentration auf der Testlinie konnte die Empfindlichkeit zunächst auf ein akzeptables Niveau gesteigert werden, wobei die Einfügung der Zwischenmembran eine ergänzende Verbesserung der Testleistung darstellte.

In dieser Arbeit haben wir Strategien beschrieben, die zur Verbesserung der Empfindlichkeit und der Nachweisgrenze von LFIAs unter Berücksichtigung der mit dem Prozess verbundenen Kosten realisierbar sind. Der in dieser Arbeit für den Testprototyp festgelegte LoD von 2,0 ng mL-1 ist mit den meisten auf dem Markt erhältlichen Schnelltests zum Nachweis des SARS-CoV-2-Antigens vergleichbar und sogar überlegen, was ihn zu einer effizienten und kostengünstigen Lösung für das Virus COVID-19 macht Verbreiten Sie die Eindämmung und Entscheidungsfindung in der Isolation der Patienten. Eine anfängliche Empfindlichkeitssteigerung auf einen akzeptablen Wert wurde durch eine Erhöhung der Fängerantikörperkonzentration auf der Testlinie erreicht. Anschließend verdoppelte das Einsetzen eines Stücks Baumwoll-Lintermaterial als Zwischenmembran zur Reduzierung der Durchflussrate und Erhöhung der Antigen-Antikörper-Kontaktzeit in den Prototyp die Empfindlichkeit des Tests und lieferte das gleiche Ergebnis wie ein Anstieg der CGC-Konzentration um 50 %, jedoch noch viel mehr erschwinglicher Ansatz. Die Gesamtempfindlichkeitssteigerung des Tests betrug im Vergleich zum ersten Prototyp etwa das Vierfache, beginnend mit 7,5 ng mL-1 (0,6 ng N-Protein pro Test) bis 2,0 ng mL-1 (0,16 ng N-Protein pro Test), mit nicht weniger Schätzungsweise mehr als 35 % Kostenreduzierung bei den Reagenzien für den endgültigen Prototyp.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Hi Technologies für die Unterstützung, Aléxia Thamara Gasparin für die Unterstützung bei der statistischen Analyse, Pâmela Fogaça Silva und Carolina Rodrigues de Araujo Perazzoli für die Bearbeitung der Bilder.

Forschungs- und Entwicklungsabteilung, Hilab, Hilab Campus, Jose A. Possebom, 800, Curitiba, Parana, 81270-185, Brasilien

Diego Rinaldi Pavesi Nicollete, Rafael Benedetti, Beatriz Arruda Valença, Keyla Kaori Kuniyoshi, Thainá Caroline Schuartz de Jesus, Ava Gevaerd, Erika Bergamo Santiago, Bernardo Montesanti Machado de Almeida, Sérgio Renato Rogal Júnior und Marcus Vinícius Mazega Figueredo

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DN, RB und BV haben diese Arbeit konzipiert und die Experimente durchgeführt. DN und RB führten eine Datenanalyse durch und verfassten den Originalentwurf. SJ und MF stellten Ressourcen und Aufsicht für das Projekt zur Verfügung. Alle Autoren haben zur Durchsicht und Bearbeitung des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Diego Rinaldi Pavesi Nicollete.

Die Autoren geben die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen an, die als potenzielle Interessenkonflikte angesehen werden können. Marcus Vinícius Mazega Figueredo ist der CEO von Hilab. Sérgio Renato Rogal Júnior ist CTO bei Hilab. Bernardo Montesanti Machado de Almeida ist CMO bei Hilab. Diego Rinaldi Pavesi Nicollete ist Innovationsmanager für Forschung und Entwicklung im Labor bei Hilab und gibt keine Interessenkonflikte bekannt. Rafael Benedetti ist Gesundheitsforscher am Hilab und gibt keine Interessenkonflikte bekannt. Keyla Kaori Kuniyoshi ist Gesundheitsforscherin am Hilab und gibt keine Interessenkonflikte bekannt. Thainá Caroline Schuartz de Jesus ist Gesundheitsforscherin am Hilab und gibt keine Interessenkonflikte an. Ava Gevaerd ist als Forscherin für die Entwicklung elektrochemischer Methoden am Hilab verantwortlich und gibt keine Interessenkonflikte bekannt. Beatriz Arruda Valença ist eine ehemalige Gesundheitsforscherin am Hilab und gibt keine Interessenkonflikte an. Erika Bergamo Santiago ist eine ehemalige Innovationsmanagerin für Forschung und Entwicklung im Labor bei Hilab und gibt kein konkurrierendes Interesse an.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nicollete, DRP, Benedetti, R., Valença, BA et al. Verbesserung der Empfindlichkeit eines SARS-CoV-2-Nukleokapsid-Antigentests mit einer kosteneffizienten Strategie durch Einsetzen einer Baumwoll-Intermembran. Sci Rep 13, 4690 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31641-5

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Eingegangen: 06. Dezember 2022

Angenommen: 15. März 2023

Veröffentlicht: 22. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31641-5

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